杨树(Populus spp.)与茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)互作中SA和H2O2的信号转导特征

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本研究以毛白杨(Populus tomentosa)和北京杨(Populus×beijingensis)为试验材料,探讨了杨树与溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)互作过程中的信号转导,重点分析了水杨酸(SA)、水杨酸甲酯(MeSA)和过氧化氢(H2O2)作为信号分子的作用及其信号转导特征,主要研究结果如下:1.检测了B. dothidea侵染后杨树内源SA含量及其相关指标的变化差异,分析了信号分子SA在杨树与B. dothidea互作中的动态特征,并初步揭示了SA与杨树的抗性相关性。接种B. dothidea后,毛白杨中游离态SA含量显著升高,接种后6h开始增加,72h时达到最高值,随后又下降,而未接种对照中游离态SA的含量变化不明显,说明B. dothidea诱导了毛白杨中SA的大量积累,SA参与了毛白杨与B. dothidea的互作过程;相对于结合态SA而言,游离态SA含量的变化总是相对敏感且显著,表明SA主要以游离态的形式参与杨树抗病防卫反应;不同抗性杨树接种B. dothidea后SA含量变化具有显著差异,毛白杨呈现出上述SA作为信号分子的典型功能特征,而北京杨接种B. dothidea后内源SA含量变化不显著,没有出现SA的迅速积累现象,在一定程度上显示了杨树对溃疡病的抗性与杨树体内游离态SA的积累密切相关。2.针对杨树与B. dothidea互作中SA的合成途径进行研究,发现B. dothidea接种毛白杨后6-12h苯甲酸(benzoic axid,BA)的含量呈下降趋势,同时苯甲酸2-羟化酶(BA2H)活性显著升高,随着接种时间的延长,BA含量增加,而苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性显著升高,说明B. dothidea侵染毛白杨后,BA由BA2H催化形成SA,但接种后期BA2H酶活性受到抑制导致BA含量的增加;与毛白杨相比较,北京杨接种后植物体内BA含量变化表现为缓慢上升趋势,整个接种期间没有出现BA含量下降现象;同时研究结果还显示,毛白杨在接种后48-72h,游离态SA与结合态SA的含量变化呈相反趋势,推测存在结合态SA向游离态SA转化的现象。3.检测了B. dothidea与杨树互作中水杨酸(SA)与水杨酸甲酯(MeSA)的相互转化特征。在不同抗性杨树中SA和MeSA含量水平不同,SA和MeSA的变化具有一定的关系;接种B. dothidea后,毛白杨被诱导导致MeSA含量水平变化显著,并在接种后48h时出现峰值,而北京杨MeSA含量没有显著变化;MeSA和SA含量变化特征揭示,接种后48h MeSA含量达到最大值,伴随着SA含量达到峰值,MeSA含量随之急剧下降,而SA含量却急剧上升,表现出一个在量上的可能转化特征;经对杨树SABP2与SAMT两个基因的克隆及其RT-PCR分析发现,毛白杨接种B. dothidea后,SAMT在12h时表达量达到最大值,SABP2则在接种后48h时表达量达到最大值,但接种前期其表达受到抑制,这与SA和MeSA含量变化相一致,进一步表明在接种点存在MeSA与SA相互转化的现象;同一植株接种后,在未被感染部位,毛白杨中MeSA与SA含量均呈现上升趋势,与接种部位相比较,未感染组织MeSA的含量水平开始上升时间晚,且最高值小,未感染组织中SA的含量比接种点SA的含量低,而北京杨中这两种信号分子并没有显著变化;毛白杨未受感染组织中SABP2基因相对表达量在整个接种期间均处于上调状态,且比接种部位SABP2的表达更活跃,而SAMT的表达量变化不显著,上调幅度不大,这些现象表明,在杨树与溃疡病菌互作体系中接种部位与未受感染部位均存在SA与MeSA通过SABP2与SAMT进行相互转化的现象,MeSA可能作为信号传递分子在杨树与病原菌互作过程中起到关键作用。4.测定了过氧化氢(H2O2)作为第二信使在B. dothidea与杨树互作中的作用,尤其在毛白杨和北京杨上的表现差异。为探讨不同互作体系中H2O2及其相关酶活性变化差异与其抗性间的关系,对毛白杨和北京杨接种后H2O2含量、CAT和APX酶活性动态变化以及水杨酸结合蛋白SABP基因相对表达进行了研究。结果显示,毛白杨在接种B. dothidea后H2O2的含量显著高于北京杨,毛白杨H2O2含量于48-72h内迅速积累,较北京杨上升快且含量高,毛白杨接种后72h时,H2O2含量达到最大值(737.52mol/g),且对照中H2O2含量没有显著变化,表明毛白杨对B. dothidea的抗性可能与植株体内H2O2的快速积累有关;为进一步研究H2O2的系统产生,用CeCl3染色的细胞化学方法对杨树韧皮部H2O2积累情况进行检测,结果表明,毛白杨在接种6h时即有沉淀积累,72h出现一个H2O2迸发高峰,大量电子沉积物累积并密集分布于细胞壁,因此细胞壁可能是诱导H2O2产生的主要部位;同样,在未受感染部位中H2O2变化趋势与接种部位相似,但CeCl3沉淀积累相对较少,初步推测杨树中B. dothidea可以诱导H2O2在整株植株中系统性产生;与抗病毛白杨相比,感病北京杨中H2O2-CeCl3沉淀颗粒很少,与利用生理学方法检测H2O2含量的结果相一致。5.对毛白杨外施SA的实验表明,SA处理与SA处理后接菌的植株中H2O2含量具有相似的变化趋势,且均显著高于对照,外源SA处理使杨树体内H2O2含量迅速升高,48h时出现一峰值,SA处理后接菌的杨树体内H2O2含量变化趋势与SA单独处理相一致,但含量水平比SA单独处理要高,且SA处理后接菌的植株在接种前期H2O2含量明显高于接菌植株,因此表明在毛白杨与B. dothidea的互作过程中,外源SA可明显促进杨树体内H2O2的积累;通过对CAT及APX的活性进行测定表明,外源SA可明显抑制CAT活性,而APX活性没有明显变化,可见,在杨树与B. dothidea互作体系中SA可能主要通过对CAT的调节作用,积累H2O2产生抗病性;克隆获得编码毛白杨水杨酸结合蛋白PtSABP和北京杨PbSABP蛋白的两个基因,RT-PCR分析表明,接种后毛白杨SABP基因的表达在6-24h时受到抑制,结合前期对SA的研究,推测此时SA与SABP结合,抑制其CAT活性,从而促使24h后H2O2含量的显著升高;因此本实验证明H2O2的变化差异是由于B. dothidea侵染杨树后引起的,SABP参与了杨树的抗病过程,表明杨树对溃疡病的抗性与H2O2的积累情况有关,在杨树的防卫反应中,H2O2位于SA下游起作用。
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