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[目 的]组织再生可以为修复人体组织器官缺损提供更优的策略,同时也面临更大的挑战。是否能实现与正常组织近似或相同的内稳态平衡是评价组织再生成功的标准之一。其中种子细胞的选择至关重要。间充质干细胞因其持续自我更新、多向分化潜能等方面的优异特性成为近年来研究的热点,其中牙间充质干细胞的成牙能力更具优势;同时因其易获得、易培养等优点,受到包括口腔医学研究者在内的多领域的关注。间充质干细胞通过一系列信号通路调控、维持组织器官内稳态的平衡。BMP信号通路已被证实在哺乳类动物牙胚发育阶段中发挥重要作用,但BMP信号通路在维持成年阶段牙体组织内稳态平衡中的作用仍不清楚。因此,本课题旨在利用至成年阶段仍保留间充质千细胞的小鼠切牙作为模型,探索BMP信号通路通过调控间充质干细胞以维持成年小鼠切牙内稳态中的作用机制,不仅有利于进一步阐明BMP信号通路的作用机制及间充质干细胞增殖分化等生物学特性,也为精确操纵间充质干细胞的定向分化,优化牙再生策略以及将来的临床应用等提供一些基础实验依据。[方 法]1.利用免疫荧光染色检测激活的BMP信号通路“指示剂”—pSmad1/5/9在成年小鼠切牙中是否有表达以及表达的模式,并运用谱系追踪的方法观察 pSmad1/5/9 在 Gli1+MSCs（Gli1+Mesenchymal Stem Cells,Gli1 阳性的间充质干细胞）、TACs（Transit Amplifying Cells,转运扩增细胞）及其子代细胞中是否有表达;2.运用Cre-LoxP重组系统构建Gli1-CreERT2;Bmpr1afl/fl转基因小鼠,利用他莫昔芬诱导,敲除出生后1月龄Gli1-CreERT2;Bmpr1afl/fl小鼠切牙Gli1+MSCs子代细胞中的Bmpr1a。采用Micro-CT、HE染色、免疫荧光染色及RNAscope原位杂交等方法检测是否成功敲除Bmpr1a,并观察实验组小鼠切牙颈环结构、成牙本质细胞、成釉细胞、小鼠切牙生长等变化;3.运用rtTA-tetoCre重组系统构建K14-rtTA;tetO-Cfre;Bmpr1afl/fl转基因小鼠,利用多西环素诱导,敲除出生后1月龄K14-rtTA;tetO-Cre;Bmpr1afl/fl小鼠切牙Gli1标记的上皮干细胞子代细胞中的Bmpr1a。采用Micro-CT、HE染色、免疫荧光染色及RNAscope原位杂交等方法观察实验组小鼠切牙颈环结构、成牙本质细胞、小鼠切牙近端牙本质等的改变,分别和对照组Bmpr1afl/fl及实验组Gli1-CreERT2;Bmpr1afl/fl小鼠进行对比研究,进一步明确BMP信号通路通过调控间充质干细胞对成年小鼠切牙G1i1+MSCs增殖及分化的影响;4.采用免疫荧光染色、TUNEL分析、RNAscope原位杂交、RNAscope多重荧光染色、RT-PCR,Image J图像分析等方法研究BMP信号通路通过调控间充质干细胞影响成年小鼠切牙G1i1+MSCs增殖及分化的相关作用机制;5.构建 Glil-LacZ、Gli1-CreERT2;Gli1-LacZ、Gli1-CreERT2;Bmpr1afl/fl;Gli1-LacZ、Glil-CreERT2;tdTomato、Glil-CreERT2;Bmprlafl/fl;tdTomato 多种转基因小鼠,采用免疫荧光染色法观察敲除成年小鼠切牙G1i1+MSCs子代细胞中的Bmpr1a后,对Gli1+MSCs分化速率以及对Glil+MSCs自身维持是否产生影响。[结 果]1.出生后1月龄对照组Bmpr1afl/fl小鼠切牙中激活的BMP信号（pSmad1/5/9阳性）主要表达在前成牙本质细胞/成牙本质细胞区以及牙髓,少量表达在TACs,不表达在G1i1+MSCs区。出生后1月龄对照组Bmpr1afl/fl小鼠切牙Ki67和pSmad1/5/9抗体的双重染色显示,pSmad1/5/9阳性信号与TACs在前成牙本质细胞/成牙本质细胞区出现共定位。谱系追踪结果显示,他莫昔芬诱导后第1天,G1i1+MSCs（tdTomato+）位于间充质干细胞龛,pSmad1/5/9在该区域不表达,二者之间未见共定位;他莫昔芬诱导后1周,G1i1+MSCs离开间充质干细胞龛,开始迁移到TACs区域,此时其子代细胞与pSmad1/5/9在前成牙本质细胞/成牙本质细胞区有共定位;他莫昔芬诱导后4周,随着Gli1+MSCs的子代细胞分化为成牙本质细胞和牙髓细胞,它们与pSmad1/5/9呈现广泛共定位。2.对实验组Gli1-CreERT2;Bmpr1afl/fl和对照组Bmpr1afl/fl小鼠下颌骨进行Micro-CT扫描和三维重建结果显示,随着诱导时间延长,实验组小鼠切牙自近端向远端牙本质缺损范围扩大,提示BMP信号的丧失会影响Gli1+MSCs向成牙本质细胞的分化及牙本质的形成,最终影响切牙的生长。HE染色结果显示,用他莫昔芬对出生后1月龄Gli1-CreERT2;Bmpr1afl/fl小鼠诱导4周后,其切牙颈环圆弧状结构消失,细胞排列紊乱,难以区分正常解剖层次,未见牙本质及牙釉质的形成:免疫荧光染色和RNAscope原位杂交结果也证实随着他莫昔芬诱导时间的延长,Amelx（Amelogenin,牙釉原蛋白）和 Dspp（Dentin sialophosphoprotein,牙本质涎磷蛋白）在Gli1-CreERT2;Bmpr1afl/fl小鼠切牙中的表达由近端向远端减少;他莫昔芬诱导8周后,Gli1-CreERT2;Bmpr1afl/fl;tdTomato小鼠牙髓组织严重紊乱,在牙髓腔中观察到异位软骨细胞,这种异位软骨细胞呈现Collagen Ⅱ阳性和tdTomato阳性,说明敲除Gli1+MSCs子代细胞中的Bmpr1a后,改变了Gli1+MSCs子代细胞的命运,使其由向成牙本质细胞分化转变为向软骨样细胞分化。3.用多西环素对出生后1月龄K14-rtTA;tetO-Cre;BmpBmpr1afl/fl转基因小鼠诱导4周后,CT扫描及三维重建结果显示小鼠切牙近端未见明显的牙本质缺损,长度也未见明显变短;HE染色结果显示,K14-rtTA;tetO-Cre;Bmpr1afl/fl小鼠颈环结构改变轻微,仍可见圆弧状结构,可区分外釉上皮和内釉上皮;RNAscope原位杂交结果显示,K14-rtTA;tetO-Cre;Bmpr1afl/fl小鼠切牙的前成牙本质细胞/成牙本质细胞区均可观察到Dspp 阳性信号,提示BMP信号通路主要通过调控Gli1+MSCs,而不是上皮干细胞来影响成牙本质细胞的分化及牙本质的形成。4.用他莫昔芬诱导出生后1月龄Gli1-CreERT2;Bmpr1afl/fl小鼠1周后,和对照组Bmpr1afl/fl小鼠比较,Ki67信号在TACs区明显减少,而在前成牙本质细胞/成牙本质细胞区异位升高,凋亡信号没有明显变化。采用Axin2和Etv4作为“指示剂”,分析WNT和FGF信号通路在小鼠切牙中的表达。结果显示,在对照组Bmpr1afl/fl小鼠切牙中,Axin2和Etv4在TACs区高表达,而在前成牙本质细胞/成牙本质细胞区表达量很少;敲除Bmpr1a后,Axin2和Etv4在TACs区表达量明显减少,但在前成牙本质细胞/成牙本质细胞区异位升高,Wnt10a和Fgf3也出现相同的改变,RT-PCR分析也证实Axin2和Etv4的升高。Axin2和Etv4的改变和Ki67变化相同。提示在Glil+MSCs增殖分化的过程中,BMP信号通路拮抗WNT/FGF信号通路,在Gli1+MSCs增殖形成TACs的过程中,需要BMP信号通路的抑制,WNT/FGF信号通路的激活;TACs分化形成成牙本质细胞时,在前成牙本质细胞/成牙本质细胞区则需要WNT/FGF信号通路的抑制、BMP信号通路的激活。当敲除Bmpr1a后,BMP信号通路不能对WNT/FGF信号通路发挥拮抗作用,故在前成牙本质细胞/成牙本质细胞区出现Axin2和Etv4的异位升高,继而使Gli1-CreERT2;Bmpr1afl/fl小鼠TACs保持异位增殖的状态而无法向成牙本质细胞分化,最终造成牙本质形成缺陷。这也体现了信号通路之间的层级关系,它们通过相互作用组成信号调控网络精密控制Gli1+MSCs的增殖与分化。5.敲除成年小鼠切牙Gli1+MSCs子代细胞中的Bmpr1a后,在Gli1-CreERT2;Bmpr1afl/fl;Gli1-LacZ小鼠切牙中Gli1+MSCs数量明显减少;同时,用他莫昔芬诱导出生后1月龄Gli1-CreERT2;Bmpr1afl/fl;tdTomato小鼠两周后发现,在切牙远端Gli1+MSCs子代细胞数量较对照组减少,提示BMP信号的缺失使Gli1+MSCs分化速率减慢。综合以上实验结果提示,BMP信号的缺失不仅可以影响Gli1+MSCs的增殖及分化,还可反馈作用于Gli1+MSCs本身,使Gli1+MSC自身的维持受损,影响内稳态的平衡。[结 论]本研究探讨BMP信号通路调控间充质干细胞维持成年小鼠切牙内稳态平衡的重要作用及调控机制。利用他莫昔芬进行诱导,条件性敲除Gli1+MSCs子代细胞中的Bmpr1a,造成BMP信号通路的缺失,影响Gli1+MSCs的增殖及分化,改变Gli1+MSCs子代细胞的细胞命运,最终导致牙本质形成障碍和切牙生长受阻。此外,BMP信号通路作为一个关键的调控因素,与WNT/FGF通路组成信号网络,通过拮抗WNT/FGF信号通路调节Gli1+MSCs的增殖与分化。此外,在Gli1+MSCs子代细胞中BMP信号的缺失导致Gli1+MSCs自身数量的减少及向子代细胞分化速率减慢。这表明BMP信号通路不仅对Gli1+MSCs增殖及分化很重要,而且还可反馈作用于Gli1+MSCs本身,使Gli1+MSCs自身的维持受损。BMP信号通路通过作用于间充质干细胞在维持成年小鼠切牙内稳态的过程中发挥双重调控作用。