脑老化是老龄最重要的生理改变,也是阿尔茨海默病(AD)等多种神经退行性疾病的重要危险因素。目前对已确诊的AD患者尚无有效的逆转的方法,因此研究如何在早期延缓脑老化、改善认知功能对防治AD等老年期痴呆具有重要的医学及社会意义。与AD相比,老龄相关认知障碍(Aging associated cognitive impairment,AACI)以脑组织功能改变为主,而未达到神经元死亡等病理状态。有研究证实老年人的认知能力具有一定的可塑性;动物实验也证实,在正常老化过程中海马及颞叶皮层仍然具有突触可塑性。老龄脑神经元及突触具有的可塑性及再可塑性机制,使得处于老龄状态下的大脑,仍具有对外来干预的有效响应能力。海马是学习记忆相关的重要脑区,海马萎缩是老年痴呆的重要病理表现。相对结构改变而言,老龄状态下海马及其不同亚区功能状态的失调是AACI的主要原因。采取措施对老龄脑认知相关脑区的功能进行干预,完全有可能延缓认知障碍的发生。重复经颅磁刺激(Repetitive transcranial magnetic stimulation,r TMS)是一种安全、无创、价廉的颅外刺激方法,通过调节刺激频率、刺激强度等参数,可以影响神经元活性,改善脑功能,从而发挥不同的调节作用。目前r TMS在临床主要用于神经、精神系统疾病的治疗,可以改善此类疾病的相关症状,如改善抑郁程度,减轻帕金森病相关非运动症状,调节阿尔兹海默病人的认知功能。有研究表明,长期高频r TMS还可以抑制正常老化过程中的认知功能损伤。重复经颅磁刺激(r TMS)对个体认知功能的提高是通过网络化、多通路的方式改善脑组织结构和功能发挥作用的。关于基因、蛋白、代谢产物的研究表明r TMS可以通过改善神经元可塑性相关的基因和蛋白的表达以及代谢产物保护神经元,进而改善认知功能。一般认为低频刺激有抑制神经元兴奋性的作用而高频刺激有兴奋作用。已有研究提出r TMS的作用具有状态依赖性,在老龄脑这一特殊的背景下,高频r TMS能否发挥同样的正向作用?r TMS在影响老龄脑认知功能,调节神经元兴奋性所涉及的具体作用机制尚待探讨。后基因组时代强调从整体上研究生物体的功能。应用生物体体液和组织对机体病理机制进行代谢组学检测,并结合非靶标多元统计分析方法,可以发现在疾病预防和治疗过程中机体生化改变的标志性物质。气相色谱-飞行时间质谱法(Gas chromatography-time of flight-mass spectrometry,GC-TOF-MS)具有检测灵敏度高,可重复性的特点,是目前研究代谢组学常用的的分析工具。已有的代谢组学研究发现正常老龄脑的代谢谱与成年对照人员相比发生了明显变化。r TMS干预后的老龄脑代谢谱如何变化、是否存在于认知相关的代谢产物变化,尚无明确报道。啮齿类动物作为实验动物模型,与人脑老化及老化相关的认知功能障碍具有很多相似性。研究显示老龄昆明小鼠可表现出认知功能的损伤,伴有海马和前额皮层突触结构和功能的变化,是研究正常脑老化的非常适合的动物模型。新异物体识别和Morris水迷宫实验,作为经典的测量海马相关学习记忆能力的行为学方法,可以用于对小鼠进行认知功能评估。本研究选取老龄昆明小鼠给予两种不同频率高频r TMS处理,通过动物行为学实验检测其认知相关行为表现,观察高频r TMS对老龄鼠认知功能是否有改善;采用透射电镜法观察海马区脑组织及突触超微结构的改变,通过PCR array及免疫印迹技术观察海马突触可塑性相关基因及蛋白水平的变化,分析其相互作用关系,探讨高频r TMS是否影响老龄脑突触结构及功能可塑性;应用GC-TOF-MS结合正交偏最小二乘法判别分析和主成分分析方法测定小鼠脑组织代谢产物,探讨高频r TMS是否影响脑组织认知相关代谢水平,进一步寻找可能的认知相关代谢标志物。为进一步在老年人群中应用高频重复经颅磁刺激作为延缓脑老化的早期干预手段提供理论依据。第一部分高频重复经颅磁刺激改善小鼠老龄相关认知功能障碍目的:观察高频r TMS是否能够改善老龄昆明小鼠的认知行为,证明高频r TMS对老龄脑认知功能的影响。方法:动物分组及方法:3月龄及15月龄雄性昆明小鼠,由河北医科大学实验动物中心提供,分笼在实验室恒温20-25摄氏度饲养,室内明暗周期12h/12h,自由饮食。通过行为学实验先对15月龄小鼠进行认知能力评价,然后依据认知成绩随机分配入老龄sham组及两磁刺激组,确保三组小鼠起始认知水平相当。依照不同磁刺激方案,小鼠共分为以下4组进行r TMS干预:(1)青年sham组:3月龄昆明小鼠30只,将磁刺激线圈置于小鼠颅顶上方,不接触颅顶,以磁头反面进行与r TMS组相同的操作。(2)老龄sham组:15月龄昆明小鼠30只,将磁刺激线圈置于小鼠颅顶上方,不接触颅顶,以磁头反面进行与r TMS组相同的操作。(3)5Hz r TMS组:15月龄昆明小鼠30只,MCF-b65型8字线圈置于小鼠颅顶上方,不接触颅顶,进行每天10串频率为5Hz的磁刺激,总共1000个脉冲,刺激强度为20%最大输出强度;连续14天。(4)25Hz r TMS组:15月龄昆明小鼠30只,MCF-b65型8字线圈置于小鼠颅顶上方,不接触颅顶,进行每天10串频率为25Hz的磁刺激,总共1000个脉冲,刺激强度为20%最大输出强度;连续14天。磁刺激后观察小鼠自主活动,并进行新异物体识别(NOR)及Morris水迷宫(MWM)实验,检测小鼠认知行为。结果:1 r TMS对小鼠自主活动行为无影响正常老龄鼠自发活动比青年鼠减少;不同频率老龄r TMS组与老龄sham组比较,自主活动次数均无显著差异,提示本实验所采用的高频磁刺激方案对老龄鼠自发活动无影响,具有安全性。2 r TMS显著改善小鼠非空间记忆能力2.1老龄鼠非空间记忆能力降低r TMS干预前,NOR训练后1 h,与青年sham组相比,老年sham组认知指数(Discriination index,DI)显著下降(P<0.05);老龄各组之间无显著差异。训练后24 h时间点,与青年sham组相比,老年sham组DI显著下降(P<0.05);老龄各组之间无显著差异。2.2 r TMS显著改善老年小鼠非空间记忆能力r TMS干预后,NOR训练后1 h,与老年sham组比较,5Hz及25Hz r TMS组小鼠DI指数均显著提高(P<0.05)。在训练后24 h时间点,与老年sham组比较,仅5Hz r TMS组小鼠DI指数显著提高(P<0.05),提示5Hz r TMS干预在改善近时及远时记忆方面均有作用,25Hz r TMS干预仅对近时记忆有明显改善作用。两时间点5Hz及25Hz r TMS组作用组间相比较均无显著差异。3 r TMS显著改善小鼠空间学习记忆能力Morris水迷宫定位航行实验显示:与老龄sham组相比,青年sham组小鼠平均寻台潜伏期缩短,差异有显著性(P<0.05)。与老龄sham组相比,两r TMS组平均寻台潜伏期均缩短,5Hz组比25Hz r TMS组差异更具有显著性(P<0.01)。空间探索实验显示,与青年sham组相比,老龄sham组小鼠原平台所在象限探索距离百分比及穿越平台次数显著减少(P<0.05);与老龄sham组相比,5Hz r TMS组在原平台所在象限探索距离百分比显著增加,5Hz及25Hz r TMS组小鼠穿越原平台所在位置次数均有显著增加(P<0.05)。以上结果显示,与青年鼠相比,老龄鼠空间学习及记忆能力显著下降;5Hz r TMS干预及25Hz r TMS干预在改善老龄鼠空间学习记忆方面均有作用,但5Hz r TMS干预组比25Hz r TMS组表现出更好的学习记忆能力,提示5Hz r TMS干预的作用可能优于25Hz r TMS干预。第二部分高频重复经颅磁刺激改善老龄鼠海马突触结构可塑性目的:从神经元及突触结构可塑性方面探讨高频r TMS改善老龄小鼠认知功能障碍的可能机制。方法:选取第一部分15月龄昆明小鼠,每组18只用于本部分实验。实验分组如下:(1)sham组:15月龄昆明小鼠18只,将磁刺激线圈置于小鼠颅顶上方,不接触颅顶,以磁头反面进行与r TMS组相同的操作。(2)5Hz r TMS组:15月龄昆明小鼠18只,MCF-b65型8字线圈置于小鼠颅顶上方,不接触颅顶,进行每天10串频率为5Hz的磁刺激,总共1000个脉冲,刺激强度为20%最大输出强度;连续14天。(3)25 Hz r TMS组:15月龄昆明小鼠18只,MCF-b65型8字线圈置于小鼠颅顶上方,不接触颅顶,进行每天10串频率为25Hz的磁刺激,总共1000个脉冲,刺激强度为20%最大输出强度;连续14天。磁刺激干预结束后,分别于刺激后1天(NOR实验后)及7天(MWM实验后)将小鼠处死,取海马组织,通过透射电镜法,观察r TMS对海马神经元及突触超微结构的影响;以Western blotting法检测神经元前体标志物及突触前、后膜标志蛋白的变化。结果:1 r TMS可以影响老龄状态下神经元超微结构形态及突触结构参数变化1.1神经元超微结构形态变化r TMS刺激7天,sham组,5Hz r TMS组及25Hz r TMS组小鼠海马神经元结构均可见:胞膜较完整,胞质基质分布较均匀,胞核和核膜结构较完整,未达到AD所具有的典型的病理表现,但细胞内均不同程度地出现脂褐素沉积,5Hz及25Hz r TMS组脂褐素沉积出现几率及沉积物大小较sham组有下降趋势,5Hz r TMS组较25Hz r TMS组降低更明显。此外,Sham组可见线粒体形态僵硬,嵴膜融合,部分高尔基体模糊,核糖体数目减少;5Hz r TMS组及25Hz r TMS组线粒体内外膜和线粒体嵴清晰可见,形态饱满。提示高频r TMS对神经元超微结构形态有一定影响,推论r TMS可能改善线粒体相关的细胞脂质代谢及能量代谢过程。1.2突触参数变化选取典型的Gray I型突触计数突触后致密物(PSD)厚度(nm)、突触间隙宽度(nm)、突触曲率及穿孔突触数。r TMS后1天的数据显示:与Sham组比较,5Hz r TMS组穿孔突触比率显著增加、突触间隙宽度显著下降,突触曲率显著增加;25Hz r TMS组PSD厚度显著增加(P<0.05)。r TMS后7天数据显示:与Sham组比较,5Hz r TMS组PSD厚度显著增加、突触间隙宽度显著下降(P<0.05);25Hz r TMS组对各突触参数的影响无显著意义。与5Hz r TMS组比较,25Hz r TMS组在r TMS后1天可见突触曲率显著增加,在r TMS后7天表现为突触宽度显著增加(P<0.05),提示(1)在r TMS后1天及7天,突触超微结构参数都受到了影响,随着时间推移受影响的突触结构也在不断变化;与sham组相比,r TMS后1天比7天时间点,受影响的参数更多,推测r TMS的近时效应比远时效应更显著;(2)在1天及7天时间点,5Hz r TMS组均比25Hz r TMS组对突触参数的影响更明显,推测5Hz r TMS作用可能优于25Hz r TMS。2 r TMS增加老龄鼠海马区神经元前体标志蛋白DCX及突触标志蛋白SYN、PSD95表达Western blot结果显示,r TMS后1天:与sham组小鼠相比,神经元前体标志物Doublecortin(DCX)在5Hz r TMS组表达增加(*P<0.05),而25Hz r TMS组表达无显著差异;r TMS后7天,DCX表达在三组间比较无显著差异。突触前标志物突触素(SYN)及突触后标志物PSD95,在r TMS后1天及7天显示出相同的变化趋势,即与sham组小鼠相比,两r TMS组蛋白表达均明显升高(P<0.05),并且5Hz与25Hz之间比较变化无明显统计学差异,提示5Hz r TMS后短时间内DCX可能呈一过性增高,而突触标志蛋白在r TMS后短时及长时阶段均有增加。第三部分高频重复经颅磁刺激调节老龄鼠海马突触功能可塑性相关基因及蛋白水平目的:从突触功能可塑性方面探讨高频r TMS改善老龄小鼠认知功能障碍的可能机制。方法:第一部分Morris水迷宫行为学实验结束后,选取三组老龄小鼠,每组12只,进行本部分实验研究,具体磁刺激干预方案及分组如下:(1)sham组:15月龄昆明小鼠12只,将磁刺激线圈置于小鼠颅顶上方,不接触颅顶,以磁头反面进行与r TMS组相同的操作。(2)5Hz r TMS组:15月龄昆明小鼠12只,MCF-b65型8字线圈置于小鼠颅顶上方,不接触颅顶,进行每天10串频率为5Hz的磁刺激,总共1000个脉冲刺激,刺激强度为20%最大输出强度;连续14天。(3)25 Hz r TMS组:15月龄昆明小鼠12只,MCF-b65型8字线圈置于小鼠颅顶上方,不接触颅顶,进行每天10串频率为25Hz的磁刺激,总共1000个脉冲刺激,刺激强度为20%最大输出强度;连续14天。磁刺激干预结束后7天(MWM实验后)处死小鼠,取海马组织,以PCR微阵列法(PCR array)高通量检测海马突触可塑性相关基因变化模式,分析不同磁刺激方案对突触功能可塑性相关通路的影响,并采用免疫印迹及免疫组化法观察突触可塑性相关通路蛋白表达水平的变化。结果:1 r TMS对老龄昆明小鼠突触可塑性相关基因的影响根据功能将微阵列中84个突触可塑性相关基因归为十类,包括:即刻早期基因(IEGs),晚反应基因(Late Response Genes),LTP相关基因,LTD相关基因,细胞粘附(Cell Adhesion)相关基因、CREB反应元件辅助因子(CREB Cofactors)、细胞外基质及蛋白酶解相关基因(Extracellular Matrix&Proteolytic Processing,EMPP)、神经受体(Neuronal Receptors,NR)、突触后致密物(Postsynaptic Density,PSD)相关基因及其他与突触转运相关的基因。结果显示,差异基因主要集中归属于CREB反应元件辅助因子、LTP、PSD相关基因及IEGs等几个大类。不同频率磁刺激可使老龄昆明小鼠突触可塑性相关基因表达模式发生改变。根据基因变化情况,我们选择上调或下调超过1.5倍作为差异基因入选标准,共发现有58种基因在三组间两两比较时至少出现一次大于1.5倍的改变。与假刺激组相比,5 Hz r TMS组有12个基因至少上调1.5倍,其中4个上调大于2倍:Bdnf、Adcy1(AC1)、Dlg4(Psd95)、Camk2g,且差异有统计学意义,上调倍数最高的基因为Bdnf 4.22倍。仅有一个有意义的下调基因Ppp1ca(PP1):下调2.08倍。与假刺激组相比,25 Hz r TMS组差异基因显著减少,仅有3个基因至少下调2倍:Timp1、Tnf-α、Nt-4/5,最大下调2.64倍。5 Hz组与25 Hz组比较出现21个差异基因,均为上调趋势,其中10个变化大于2倍,最大上调基因为Bdnf 3.27倍。结合KEGG(京都基因与基因组百科全书)通路分析发现,5 Hz组与sham组比较,差异基因与神经营养因子通路、c AMP信号通路中的因子有较多重叠;25 Hz组与sham组比较,差异表达基因仅有3个,作用无集中在某一通路的倾向;5 Hz组与25 Hz组比较,差异基因与谷氨酸能突触相关通路中的多个因子重叠。2 r TMS对老龄昆明小鼠突触可塑性相关蛋白的影响2.1 r TMS促进老龄海马突触可塑性相关蛋白BDNF及p CREB的表达Western blotting结果显示:与sham组比,两个刺激组CREB总蛋白水平无明显变化(P>0.05),但在5 Hz r TMS组其磷酸化蛋白p CREB明显提高(P<0.05)。25 Hz r TMS组也有增加的趋势,但差异无显著性。BDNF蛋白变化显现出与磷酸化p CREB一致的模式,即5 Hz r TMS组蛋白表达水平明显提高;25 Hz r TMS组增加不明显。2.2 r TMS促进老龄鼠海马DG区BDNF及p CREB的表达免疫组织化学染色结果显示:反应阳性细胞呈棕黄色,弥散分布在海马区,在海马各亚区神经元及胞浆均有不同程度着色。5Hz r TMS组可见BDNF及p CREB在老龄脑海马,特别是DG区,阳性细胞较sham组明显增加,而总CREB表达在各组间及海马各亚区之间无明显差异。两刺激组比较无显著差异。第四部分高频重复经颅磁刺激调节老龄鼠认知相关海马代谢产物变化目的:从代谢组学角度观察r TMS作用后脑组织的代谢差异物质,探索高频r TMS改善老龄小鼠认知功能障碍的可能代谢标记物。方法:第一部分NOR行为学实验结束后,选取三组老龄小鼠,每组6只,进行后续代谢组学检测,磁刺激干预方案及分组同第三部分。应用气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOF-MS)分析方法对小鼠海马组织代谢产物进行检测,应用主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares analysis,OPLS-DA)方法对结果进行分析,进一步应用两两比较的t检验统计方法深入分析差异代谢物。将筛选出的差异物质与老龄小鼠NOR行为学成绩进行相关性分析,寻找与认知相关的小分子代谢物。结果:1 r TMS对老龄鼠海马组织代谢产物的PCA分析及OPLS-DA分析r TMS干预可以使脑组织代谢物轮廓发生变化,共得出499个离子峰用来做进一步分析。采用SIMCA-P软件进行PCA多元分析,PCA得分图显示,三组样本分布于三个不同的区域,但各群之间分离度不显著。为了得到更精确的结果,应用OPLS-DA分析以最大程度的区分两组之间的差异物,结果显示两两比较时不同组别均分布到不同的区域,并且所有样本均在95%可信区间范围内,三组两两比较时不同组别均分布到不同的区域,R2Y值分别为:0.983,0.994和0.990,Q2Y值分别为:0.423,0.732和0.678,说明该模型稳健并有很好的预测性。此外,7倍交叉验证和200次置换检验显示两两比较时Q2值均较低,进一步证实模型稳健性和预测性良好。2 r TMS影响老龄鼠海马代谢产物的差异分析应用SPSS13.0对这些变量进行进一步统计分析,根据variable importance in the projection(VIP)>1且P<0.05作为标准,sham v.s.5Hz r TMS有28个变量被选出来,sham v.s.25Hz r TMS有13个变量被筛选出来,详见Table1;5Hz r TMS v.s.25Hz r TMS仅有1个变量满足筛选条件,所对应物质为胆固醇(Cholesterol,Cho),similarity:722(reliable),VIP=1.9959,P=0.0400,Fold change:上调0.92倍。进一步观察发现,与sham相比,在5Hz r TMS组仅反油酸(Ela)大幅(>2倍)降低,油酸(Ole)、十二烷酸(Lau)、戊酮酸(Ket)、亚油酸(Lin)、酵母甾醇(Zym)、氨基丙二酸(Ama)、葡萄糖内酯(Gll)均大幅升高。25Hz r TMS组油酸、十二烷酸、亚油酸、酵母甾醇、葡萄糖内酯也大幅升高,大幅下降的只有槐二糖(Sop)。这些有显著变化的差异物质中油酸及十二烷酸均为可靠指认物质,其变化差异均超过20倍;其余物质均为推定成份。3差异代谢产物与认知功能的相关性分析将所筛选出的可靠差异代谢物油酸及十二烷酸与第一部分老龄小鼠的NOR实验DI成绩进行相关性分析,以|Pearson相关系数|>0.5和P<0.05为标准,最终发现油酸(oleic oil)与r TMS干预老龄脑后的认知改变密切相关,而十二烷酸无显著相关性。结论:1老龄昆明小鼠的认知功能较青年鼠出现下降,是研究正常老人群脑老化的理想模型;应用高频r TMS可以改善老龄相关认知功能下降。5Hz及25Hz高频r TMS方案均具有良好的安全性。2高频r TMS可以改善老龄脑神经元突触结构可塑性,突触结构可塑性对r TMS的响应模式可能随时间变化,近时效应优于远时效应;在突触前及突触后均有作用;高频r TMS可以改善老龄脑海马突触功能可塑性,5Hz高频r TMS可能通过激活c AMP/PKA/CREB及BDNF-Trk B/CREB相关环路,发挥正性调控作用,BDNF及活化的CREB是其中的关键因子。海马DG区可能是r TMS发挥作用的主要部位。3高频r TMS可以影响老龄鼠海马组织代谢谱,在这些差异代谢产物中,油酸及十二烷酸含量增加,其中油酸可能是一个较为特殊的与认知功能相关的潜在代谢标志物。4总体而言,5Hz频率的刺激在改善老龄脑认知功能及相关机制方面的作用比25Hz磁刺激明显。