【摘 要】
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在单萜吲哚类生物碱的合成途径中,异胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase,STR)催化色胺和裂环马钱子苷生成异胡豆苷。本研究基于钩藤(Urcaria rhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.)转录组Blast分析,得到全部的STR成员,通过生物信息学分析得到候选基因,通过对候选基因进行克隆、表达分析、亚细胞定位、原核表达、启动子的克隆及活性验证等几方面的
【基金项目】
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生物学一流学科开放基金“黔产钩藤中活性成分合成关键基因 STR 的筛选鉴定与转基因研究”(GNYL[2017]009FX1KT12); 贵州省基础研究计划“PIF3 介导光信号调控钩藤中生物碱合成的分子机制研究”(黔科合基础-ZK[2022]一般 096); 贵州大学引进人才科研项目“rol 基因遗传改造的抗胆碱药药源颠茄分子育种
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在单萜吲哚类生物碱的合成途径中,异胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase,STR)催化色胺和裂环马钱子苷生成异胡豆苷。本研究基于钩藤(Urcaria rhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.)转录组Blast分析,得到全部的STR成员,通过生物信息学分析得到候选基因,通过对候选基因进行克隆、表达分析、亚细胞定位、原核表达、启动子的克隆及活性验证等几方面的实验内容,得到以下研究结果:1)钩藤中MIA合成途径中STR基因的挖掘通过转录组分析在转录组中鉴定到25条STR家族成员,将筛选得到的STR家族成员与报道过的其它植物中STR进行系统进化树构建,钩藤Ur STR基因被分为3个亚家族。综合分析其motifs、保守结构域、系统进化树以及基因的表达情况等,选择UR_transcript_32 860作为钩藤中候选STR基因进行克隆。2)候选基因及启动子的克隆提取转录组中UR_transcript_32 860,分析并设计STR基因核心序列特异性引物,通过染色体步移技术扩增Ur STR基因及上游启动子,结果表明:Ur STR基因ORF框全长1 038 bp,编码345个氨基酸,属于不稳定蛋白;Ur STR基因上游有5’UTR区287 bp,克隆到启动子长1 179 bp。3)候选基因编码蛋白的功能定位及原核表达分析构建Ur STR基因编码蛋白的亚细胞定位表达载体,共定位实验结果表明,Ur STR蛋白定位表达于液泡膜,进一步证明Ur STR基因属于植物中STR基因家族;生物信息学分析表明Ur STR基因编码蛋白具有信号肽,设计引物去除信号肽构建原核表达载体,成功在Rosseta(DE3)感受态细胞中表达出重组蛋白。4)候选基因启动子的活性验证克隆得到的Ur STR基因启动子顺式作用元件分析表明,启动子区具有脱落酸、光照和茉莉酸甲酯等顺式作用元件,没有乙烯顺式作用元件。构建PI121-STRpro::GUS表达载体验证Ur STR基因启动子活性。5)候选基因的表达分析实时荧光定量PCR检测钩藤中不同组织、发育表达情况,外源激素脱落酸、乙烯处理和光照处理下的Ur STR基因表达情况,结果表明:Ur STR基因是组织表达性基因,在钩藤各组织中均有表达;Ur STR基因随着叶片的成熟,表达量逐渐降低;Ur STR基因会受到脱落酸、光照等诱导表达,乙烯处理下表达不显著。
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