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鱼类性别控制研究是现代水产养殖的热点。金钱鱼(Scatophagus argus,Linnaeus,1766)是一种广盐性鱼类,可作观赏鱼和食用鱼,在养殖群体中性比为1:1。金钱鱼雌鱼的生长比雄鱼快,个体大,有更好经济价值。因此,克隆性别决定主效基因(master sex-determination gene,SD)将有助于金钱鱼的性别控制。本研究旨在研究金钱鱼的性别决定和分化机制,并为以后的单性(全雌鱼)金钱鱼培育提供理论基础。下面为本研究的主要发现:1、金钱鱼性别特异性标记的开发和性别决定候选基因的克隆本研究克隆了金钱鱼Dmrt1(Dmrt1和Dmrt1b)和Dmrt3(Dmrt3和Dmrt3△-Y)的两个亚型。本研究开发了两个位于金钱鱼Dmrt3和Dmrt1上的性别连锁分子标记,分别命名为Dmrt3-Marker-F/R和Dmrt1-Marker-F/R。Dmrt3-Marker-F/R扩增的片段包含能导致截短型Dmrt3(Dmrt3△-Y)c DNA提前编码终止的基因组序列。Dmrt3-Marker-F/R扩增片段的151和166 bp单核苷酸多态性(SNP)显示雌性个体均为CC GG纯合型,而雄性个体均为CG GA杂合型。标记Dmrt3-Marker-F/R扩增片段的166bp是Dmrt3基因内含子的起始位置,该处SNP(c.400+1G>A)会导致Dmrt3产生截短突变。截短型Dmrt3与雄性性别连锁,因此命名为Dmrt3△-Y,它的等位基因即正常Dmrt3位于X染色体。克隆了一个正常的Dmrt1和一个截短的Dmrt1b,它们分别编码300和89个氨基酸。多重序列比较分析显示Dmrt1和Dmrt1b都具有其它物种保守的DM结构域。Dmrt1-Marker-F/R引物扩增片段为正常Dmrt1外显子2和3之间的片段,PCR产物大小为3.2 kb,且雄性特异,表明Dmrt1可能位于Y染色体上。Dmrt1b-Marker-F/R引物能够扩增1.5 kb Dmrt1b的基因组序列,雌雄均能扩增,雌雄个体序列相似度高达99%,表明Dmrt1b并非性别特异,它可能位于X染色体。RT-PCR分析发现Dmrt1只在精巢表达,而Dmrt3△-Y只在部分精巢微弱表达,而在卵巢不表达。研究初步表明雄性特异Dmrt1是金钱鱼的性别决定候选基因。Dmrt3-Marker-F/R和Dmrt1-Marker-F/R标记均在来自中国5个群体的246尾金钱鱼(113雄和133雌)中验证。后面,Dmrt1-Marker-F/R标记又在2000多尾金钱鱼中继续验证。2、金钱鱼中Gsdf的克隆表达分析及Dmrt对它的转录调控分析克隆了金钱鱼Gsdf部分c DNA序列,包含了开放阅读框654 bp,编码217个氨基酸。金钱鱼Gsdf的TGF-β含有保守的半胱氨酸残基。组织分布分析表明,金钱鱼Gsdf仅在性腺组织中表达,且其在精巢中的表达显著高于卵巢。通过实时定量PCR分析Gsdf,Dmrt1和Sf1在性腺不同发育阶段的表达水平。结果表明,Gsdf在V期精巢中的表达明显低于III期和IV期,但其V期精巢中表达水平远高于II期、III期和IV期卵巢。在卵巢中,Gsdf在II期表达最高。Dmrt1在精巢(III期、IV期和V期)的表达显著高于各期卵巢(II期、III期和IV期)。在雌鱼中,Sf1在III期的卵巢中高表达,而在精巢不同时期(在III期、IV期和V期)的表达无差异。在这项研究中,制备了山羊抗金钱鱼Gsdf抗体,免疫蛋白印迹(WB)结果表明,Gsdf在精巢中的表达比卵巢高。免疫组织化学(IHC)研究显示,Gsdf仅在II,III,IV和V期精巢的支持细胞中表达。在雌鱼中,Gsdf仅在I期,II期和III期卵巢的体细胞中表达,而在IV期卵巢几乎检测不到,表明卵巢后期Gsdf的蛋白质表达水平较低。金钱鱼Gsdf启动子的序列分析发现在-2647,-2333,-1789,-1555,-751,-201bp处共有六个Sf1结合位点,在-413 bp处有一个Dmrt1结合位点。此外,使用HEK293细胞进行启动子分析显示Sf1单独能以剂量依赖方式激活Gsdf转录,而Dmrt1单独不能激活Gsdf基因转录。当Dmrt1与Sf1共转染时,Dmrt1能够以剂量依赖性方式激活Gsdf表达。Dmrt1或Sf1结合位点的突变,都会导致Gsdf启动子活性显著降低。这些结果充分证明Dmrt1或Sf1推断的结合位点是激活金钱鱼Gsdf转录调控所必需的。结论:综上所述,在本研究中开发了两个性别特异的标记,表明金钱鱼是XX-XY性别决定系统。Dmrt3-Marker-F/R和Dmrt1-Marker-F/R分别位于Dmrt3和Dmrt1基因座内。Dmrt1b和Dmrt3位于X染色体上,而Dmrt1和Dmrt3Δ-Y位于Y染色体上。XX雌性金钱鱼缺乏具有正常功能的Dmrt1,因此它的性腺会发育成卵巢。Y染色体上雄性特异的Dmrt1和Dmrt3Δ-Y之间,Dmrt1最有可能是XY雄性金钱鱼的候选性别决定基因。此外,我们克隆了金钱鱼的Gsdf,它具有典型的TGF-β成员的共同特征。Gsdf在精巢的表达显著高于卵巢。体外启动子分析证明在金钱鱼中,Sf1存在时Dmrt1会促进Gsdf表达。本研究表明Dmrt1可能通过调控Gsdf表达而发挥雄性性别分化作用。我们的研究为水产养殖中金钱鱼性别控制提供理论依据。