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目的:
细胞表面的糖链,担负着细胞与外界信息交换的功能,有着极其重要的生物学作用。本实验以糖链为“信号天线”,将功能性糖链壳寡糖(COS)和脂多糖(LPS)嫁接到聚丁二炔(PCDA)囊泡表面,或以糖脂的形式镶嵌到PCDA囊泡中,制备相应糖脂生物传感器,并进行初步的表征和特异性研究。建立基于糖链功能化的高效、快速、灵敏、特异的纳米囊泡生物传感器,以进一步应用于病原体的检测及鉴定、疾病的诊断、药物筛选等相关研究和应用,为临床诊断、药物筛选等提供一种新的检测工具和手段。
方法:
1.PCDA-COS的制备:通过碳化二亚胺法介导COS嫁接到PCDA纳米单体,用薄层层析(TLC)法进行鉴定。
2.糖脂聚丁二炔纳米囊泡的制备与表征:以PCDA单体、PCDA-COS、DMPC和LPS为膜材,采用探头超声法制备出不同体系的聚丁二炔纳米囊泡。采用透射电镜负染技术,对囊泡进行形貌表征;用紫外-可见光吸收光谱技术,对囊泡进行特征吸收峰表征。
3.糖脂纳米囊泡生物传感器的比色荧光检测:利用COS与巨噬细胞表面的甘露糖受体间特异性结合以及LPS与COS间相互作用所引起的聚丁二炔纳米囊泡颜色变化或荧光变化来测定糖脂生物传感器与特异受体的相互作用,并计算相应比色响应值(CR%)。
结果:
1.PCDA-COS的制备:利用碳化二亚胺法介导COS嫁接到PCDA纳米单体获得连接产物PCDA-COS。TLC分析表明PCDA与COS成功连接。通过实验结果得出,PCDA与COS的最适连接反应时间为4h。
2.糖脂聚丁二炔纳米囊泡的制备与表征:经透射电镜证实,纯PCDA、PCDACOS/PCDA以及PCDA/DMPC/LPS三种体系通过超声均能形成囊泡,且直径在30~100nm之间;经254nm紫外线照射,各种囊泡均可从无色转变为蓝色。
3.基于COS的糖脂纳米囊泡生物传感器的比色荧光检测:经紫外-可见光吸收光谱分析、囊泡的蓝-红颜色的转变以及激光共聚焦显微镜观察得到的巨噬细胞表面荧光变化证实基于COS的糖脂纳米囊泡生物传感器初步构建成功,且PCDA-COS与PCDA制备囊泡的最适物料比为1:0;其与巨噬细胞作用时间较短,仅需5-15min就可观察到巨噬细胞表面的荧光变化。
4.基于LPS的糖脂纳米囊泡生物传感器的比色检测:基于脂多糖的糖脂纳米囊泡生物传感器与COS相互作用,通过紫外-可见光吸收光谱分析以及囊泡的蓝-红颜色的转变得到证实。实验结果表明,COS与PCDA/DMPC/LPS囊泡相作用的最适浓度为0.1~1mM,检测下限约为0.05mM;两者作用时间较快,仅需20minCR%值即可达17%,同时肉眼可见颜色的转变。
结论:本研究初步成功制备了基于COS以及LPS的糖脂纳米囊泡生物传感器。研究结果表明:经透射电子显微镜观察,糖脂纳米生物传感器具备明显的囊泡形貌特征;基于COS的糖脂纳米囊泡生物传感器可与巨噬细胞特异性结合,并引发囊泡产生荧光;LPS功能化的糖脂生物传感器与葡聚糖、甘露糖等多糖以及单糖不发生反应,与COS相互作用具有特异性。这些初步的表征和特异性研究为糖脂生物传感器的进一步改进和其他糖脂生物传感器的研制奠定了基础。