研究背景:α-突触核蛋白的自身聚集能力使它区别于其他功能性蛋白质,同时也是构成帕金森病等突触核蛋白病的病理基础。因此对于α-突触核蛋白自身聚集的研究显得尤为重要。α-突触核蛋白单体可以在体外通过搅拌/震荡发生自我聚集形成病理性纤维,因此可以利用这种纤维化模型去研究蛋白自身聚集机制和筛选抗纤维化药物。研究目的:但是传统的纤维化模型存在许多局限性,包括时间长、重复性差、蛋白用量大、需要连续搅拌等等。因此我们尝试在传统的纤维化模型上进行方法改进,去探讨和建立一种更加快速、简便的纤维化模型方案,以用于纤维化影响因素的探究和大规模药物筛选。研究方法:首先我们通过大肠杆菌原核表达系统获得α-突触核蛋白。然后通过无标签蛋白纯化系统进行蛋白纯化,获得高质量、无类毒素的蛋白单体。接着通过恒温物理震荡方法,使蛋白单体聚集形成蛋白纤维。形成后的蛋白纤维再经超声处理形成纤维种子。通过向单体溶液中预先添加少量纤维种子,使ThT荧光曲线跳过缓慢的成核阶段,直接进入快速的延伸阶段。并在非搅拌的条件下,使用PCR板/管作为反应的微量载体,配合RT-qPCR仪的FAM荧光通道来快速、微量的监测影响纤维延伸曲线的多种处理因素。包括温度、种子浓度、单体浓度、钠盐离子浓度、表面活性剂、种子预处理和人鼠源性蛋白互相扩增等处理手段对荧光曲线的影响。研究结果:α-突触核蛋白的原核表达和无标签纯化可以获得大量高品质、无内毒素的α-突触核蛋白单体。向α-突触核蛋白单体溶液中添加纤维种子,可以在静态条件下使纤维化反应直接进入快速的延伸阶段。利用RT-qPCR仪中的FAM荧光通道,可以快速、微量地监测出α-突触核蛋白种子在静态孵育条件下不同处理组中的ThT荧光曲线变化。研究结论:在只研究α-突触核蛋白纤维延伸而不包括成核机制的前提下,α-突触核蛋白纤维种子的静态孵育模型是一种快速、简便、能够反映出组间差异的可靠实验方案。这种方法可以成为一种高通量、快速、稳定、微量的抗/促纤维化药物筛选手段。