类胡萝卜素是一类对植物和人体健康非常重要的次生代谢物。尽管类胡萝卜素代谢研究已经取得了很大的进展,但是关于类胡萝卜素代谢调控的分子机理还不够清晰。柑橘果实含有丰富的类胡萝卜素,并且类胡萝卜素含量和组成决定了果实外观品质、营养价值和经济效益。因此,研究柑橘类胡萝卜素代谢具有重要的理论和实践意义。番茄红素β-环化酶(LCYb)是位于类胡萝卜素合成途径分支点的关键酶。大量研究表明,LCYb基因表达水平与类胡萝卜素含量和组成密切相关。但是,关于LCYb基因表达的转录调控机制还未知,在柑橘乃至整个植物界中还没有转录因子被证明能直接调控其表达。因此,本研究以柑橘LCYb基因为切入点,深入分析该基因表达模式、序列多态性以及酶活性特点;并克隆和鉴定该基因启动子序列、表达活性及其关键顺式作用元件;进一步利用酵母单杂交系统,筛选可能与LCYb启动子互作的转录因子;采用遗传学、分子生物学和生物化学等方法,验证候选转录因子参与类胡萝卜素代谢的转录调控功能。主要研究结果如下:1.LCYb基因功能分析。大多数柑橘品种含有2种类型的LCYb基因,并且每种类型又含有2个不同的等位基因(LCYb1a、LCYb1b、LCYb2a和LCYb2b)。本研究首先对暗柳和红暗柳甜橙(Citrus sinensis)中2个LCYb基因的表达进行分析,发现CsLCYb1基因具有组成型表达模式,而CsLCYb2基因具有组织特异性表达模式;有色体特异性CsLCYb2基因的表达量降低可能与红暗柳甜橙中番茄红素的大量积累有关。对不同柑橘品种LCYb2基因进行序列多态性和聚类分析,发现LCYb2基因序列的等位多态性与不同柑橘品种的进化关系密切相关。利用工程菌实验,对所获得的LCYb2等位基因分别进行功能分析,发现除了CsLCYb2b基因没有活性外,其他的等位基因均具有番茄红素β-环化酶活性,即能将红色番茄红素转变成橙色β-胡萝卜素。对甜橙2个LCYb2等位基因进行点突变分析,发现72位和359位氨基酸是影响酶活性的关键位点。2.LCYb启动子克隆和活性分析。从甜橙中克隆了CsLCYb1启动子序列,对其进行生物信息学分析和活性鉴定。将CsLCYb1启动子全长和一系列的5’端缺失片段融合到GUS报告基因上游,并转入不同植物(番茄、拟南芥和柑橘愈伤)中检测启动子活性。结果表明,从翻译起始位点开始至其上游1584 bp片段具有最强启动子活性,746 bp片段具有最基本的启动子活性。此外,CsLCYb1启动子活性在转基因拟南芥中受组织特异性和发育时期的调控,在转基因柑橘愈伤组织中受激素等各种外源因子处理的影响。进一步精细缺失分析,发现在启动子区域-574 bp到-513 bp之间存在1个增强子元件的串联重复,该串联重复数对CsLCYb1启动子活性非常重要。对不同柑橘品种LCYb1启动子序列进行分析,发现此增强子元件的拷贝数不同,从而开发出1个简单序列重复的分子标记,可用于区分不同的柑橘品种。对甜橙中2个CsLCYb2等位基因的启动子序列进行克隆和生物信息学分析,发现这2条启动子序列含有一些相同的和不同的顺式作用元件。采用番茄果实瞬时表达的方法对启动子活性进行鉴定,发现这2条启动子在有色体含量比较丰富的果实中都具有活性。3.LCYb启动子互作因子的筛选。以LCYb启动子及其关键顺式作用元件的序列为诱饵,利用酵母单杂交系统,筛选甜橙果实cDNA文库,初步获得一些能与LCYb启动子互作的调控因子。4.候选转录因子CsMADS6、CsMADS5和CsGARP4的功能鉴定。根据酵母单杂交系统筛库结果,结合前人文献报道,本研究选取了3个可能参与类胡萝卜素代谢的转录因子做进一步的功能分析。CsMADS6属于MADS转录因子家族AGAMOUS-like亚家族,其表达与果实发育和着色高度一致。作为一个核定位的转录激活因子,CsMADS6能直接结合并激活LCYb1启动子。在柑橘愈伤组织中超表达CsMADS6基因,增加了类胡萝卜素含量,诱导了LCYb1和其他类胡萝卜素基因包括PSY、PDS和CCD1的表达。进一步分析表明,CsMADS6直接与PSY、PDS和CCD1启动子结合,从而上调这些基因表达。这一结果说明,CsMADS6能多靶点调控类胡萝卜素代谢。此外,在番茄中异位表达CsMADS6基因,增加了果实中类胡萝卜素含量,促进了类胡萝卜素合成基因表达。CsMADS6超表达系萼片中类胡萝卜素组成和含量发生剧烈变化,并伴有质体超微结构的改变。对转基因萼片进行RNA-seq分析,结果显示CsMADS6调控了一系列生物途径,从而引导代谢流特异进入类胡萝卜素代谢通路。CsMADS5属于MADS转录因子家族SQUAMOSA亚家族,与拟南芥、番茄FUL蛋白同源性较高。基因和蛋白表达分析表明,CsMADS5表达水平与果实发育和色泽形成呈正相关。CsMADS5蛋白定位于细胞核中,并具有转录激活活性。生化实验证实,CsMADS5能直接与LCYb1启动子结合并激活它的活性。在柑橘愈伤中超表达CsMADS5,发现α-胡萝卜素含量显著增加;LCYb1及其他类胡萝卜素合成关键基因,包括PSY、PDS和CCD1表达也都显著上调。进一步分析表明,CsMADS5能直接结合并激活PSY、PDS和CCD1启动子。此外,在番茄中异位表达CsMADS5,导致果实中类胡萝卜素含量显著增加,类胡萝卜素相关基因表达也发生明显变化。蛋白互作分析表明,CsMADS5和CsMADS6在细胞核中能相互作用。CsGARP4属于GARP转录因子家族,该蛋白含有1个Myb_DNA-binding和1个Myb_CC_LHEQLE保守结构域。基因表达分析表明,CsGARP4在所有组织中均能表达,在叶片中表达量最高;在果实中,随着果实发育其表达量逐渐增加。作为一个核定位的转录激活因子,CsGARP4能直接结合并激活LCYb1启动子活性。在番茄中异位表达CsGARP4基因,发现转基因植株呈现缺磷表型。基因表达分析结果显示,转基因植株中CsGARP4超量表达而内源同源基因的表达不受影响。生理生化分析发现,番茄CsGARP4超表达系叶片中,类胡萝卜素含量及相关基因表达显著降低;花青素含量增加、叶绿素含量减少,伴随着相关基因表达也显著增加;总磷含量没有明显变化,但是磷饥饿诱导响应相关基因的表达受到显著影响。本研究探索和验证了3个转录因子参与LCYb基因表达和类胡萝卜素代谢转录调控的功能。CsMADS6和CsMADS5均通过直接调控LCYb1及其他类胡萝卜素关键基因,从而协同正调控类胡萝卜素代谢;并且CsMADS6还具有更广泛的调控作用,能重排转录网络,引导代谢流特异进入类胡萝卜素代谢通路。CsGARP4可能通过直接调控LCYb1基因,来调控独脚金内酯(一种类胡萝卜素衍生物)的含量,进而影响植物对磷胁迫的响应。