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疫霉菌是一类毁灭性的植物致病菌,波及范围极其广泛,会造成非常严重的经济损失,其有性生殖对于物种的延续及演化十分重要,但目前分子机理尚不明确。课题组前期工作以致病疫霉菌株P7723(A2交配型)为材料,利用蛋白质组学方法,检测了α1性激素处理后菌株的蛋白表达差异,得到了一批性激素诱导下的差异表达蛋白。本研究选择PITG-03644、PITG-04663、PITG-06415、PITG-13014、PITG-17706基因作为研究对象,对致病疫霉这5个基因的cDNA蛋白编码区进行了克隆及序列分析,并构建了其CRISPR-cas9基因编辑载体,为进一步研究这5个基因的功能以及CRISPR-Cas9基因编辑技术在致病疫霉研究中的应用奠定了基础。实验结果表明,致病疫霉菌株P7723 PITG-03644 cDNA蛋白编码区序列为609bp长,编码的氨基酸为202个,与NCBI上公布的核苷酸及氨基酸序列相似性为100%。致病疫霉菌株P7723 PITG-04663 cDNA蛋白编码区序列为1760bp长,编码的氨基酸为587个,与NCBI上公布的核苷酸及氨基酸序列相似性为100%。致病疫霉菌株P7723 PITG-06415 cDNA蛋白编码区序列为2121bp长,编码的氨基酸为706个,与NCBI上公布的核苷酸及氨基酸序列相似性为100%。致病疫霉菌株P7723 PITG-13014 cDNA蛋白编码区序列为1182bp长,编码的氨基酸为393个,与NCBI上公布的核苷酸及氨基酸序列相似性为100%。致病疫霉菌株P7723 PITG-17706 cDNA蛋白编码区序列为2337bp长,编码的氨基酸为778个,与NCBI公布的核苷酸、氨基酸序列相似性分别为99.57%和99.61%。与公布的核苷酸序列相比较,本实验克隆的序列在878-886bp处有9个碱基TTCGTCAGC的插入突变,造成其编码的氨基酸序列在第292个氨基酸处多了 3个氨基酸SAS;另外,与公布的核苷酸序列相比较,本实验克隆的序列在29bp处的C突变为T,但该突变并未引起氨基酸的改变。根据该序列预测的蛋白质三维结构与NCBI序列预测的结构完全一致,故推测二者功能没有差异。生物信息学分析显示,PITG-03644所编码的蛋白为核蛋白,可能是一个疏水性蛋白,带有典型的Rab家族和P-loop_NTPase超家族结构域。PITG-04663所编码的蛋白为核蛋白,为疏水性蛋白,带有典型的bZIP结构域、SRPBCC超家族结构域和Med15结构域。PITG-06415所编码的蛋白为胞质蛋白,为疏水性蛋白,带有典型的PTZ00272结构域。PITG-13014所编码的蛋白为胞质蛋白,为疏水性蛋白,带有典型的APP_MetAP家族结构域。PITG-17706所编码的蛋白为核蛋白,为亲水性蛋白,带有典型的bZIP结构域。这些蛋白均不含有明显的跨膜区域。针对每个基因的蛋白编码区,分别设计了 2个sgRNA靶位点,并且成功将其克隆到载体pYF515中,成功构建了 5个基因的总共10个CRISPR-Cas9基因编辑载体。