论文部分内容阅读
第一部分帕金森病小鼠模型制备及疼痛行为学评估目的:通过在小鼠左侧纹状体注射6-羟基多巴（6-OHDA）的方式构建单侧帕金森（parkinson’s disease,PD）小鼠模型,并从PD模型小鼠的自发疼痛和诱发疼痛的行为学改变等方面,对PD小鼠疼痛行为学进行系统评估。方法:将20只C57BL/6小鼠随机分为PD组和Sham组,每组各10只。采用两点法向小鼠左侧纹状体分别注射6-OHDA（PD组）和等量的生理盐水（sham组）。术后第1周和第2周分别进行阿扑吗啡（APO）诱导旋转实验,旋转实验阳性的小鼠于第2周进行机械痛,热痛,和自发痛的测试。之后每组随机选取3只小鼠,取纹状体组织蛋白,采用Western blot的方法检测纹状体内酪氨酸羟化酶（TH）的含量以及采用免疫荧光的方法检测黑质和纹状体的损伤程度。结果:1.PD组小鼠在注射6-OHDA一周后出现APO诱导的旋转反应,第1周旋转圈数为每小时622.60±21.94圈,第2周旋转圈数为每小时657.40±24.03圈。免疫荧光显示PD组模型小鼠的左侧黑质TH+神经元数量减低,左侧纹状体TH+纤维荧光强度也减低,Western blot显示纹状体TH含量较右侧明显减少,且比较有统计学差异（p<0.05）。上述结果说明,小鼠单侧纹状体内注射6-OHDA可制作稳定的PD模型。2.术后第2周,PD组小鼠右后肢的热痛痛阈较sham组明显减低,PD组小鼠左右后肢以及左右脸颊部机械痛痛阈较sham组也明显减低,且两者比较有统计学差异（p<0.05）。然而PD组小鼠没有表现出自发痛行为学,条件性位置偏爱实验结果与sham组比较无显著性差异。结论:小鼠单侧纹状体内注射6-OHDA可较好的模拟PD疾病特点,且该模型小鼠表现出热痛和机械痛痛觉过敏,可以作为研究PD疼痛的理想实验模型。第二部分TRPV1在帕金森模型小鼠疼痛发生中的机制研究目的:研究6-OHDA损伤疼痛模型小鼠的三叉神经尾侧亚核（Vc）中TRPV1的表达,以及其在PD模型小鼠疼痛发生中的作用。方法:实验采用向小鼠左侧纹状体内注射6-OHDA的方法制备单侧PD小鼠模型。术后第1周进行APO诱导旋转实验,筛选出单侧PD模型小鼠,并于第2周进行脸颊部机械痛测试,筛选出20只PD疼痛小鼠模型用于后续实验。采用免疫荧光方法检测PD疼痛小鼠模型的左右两侧Vc区5-HT,5-HT3AR,和TRPV1的含量,并检测通过基因阻断法在RVM区微量注射Tph2-sh RNA阻断5-HT分泌后,以及给予5-HT3AR拮抗剂（Y25130）和TRPV1受体拮抗剂（AMG9810）后小鼠机械痛痛阈的改变。最后在sham组小鼠右侧Vc区微量注射5-HT3AR激动剂（SR57227）或者生理盐水,检测其行为学改变,并在注射SR57227前30min原位微量注射TRPV1受体拮抗剂（AMG9810）或生理盐水,再次检测其行为学变化。结果:1.PD疼痛模型小鼠右侧Vc区的5-HT含量较左侧明显增高,两者相比有统计学差异（p<0.05）。在RVM区微量注射Tph2-sh RNA后,右侧Vc区5-HT含量明显减少,且右侧机械痛痛阈增高,和sham组小鼠相比无显著性差异。上述结果说明,RVM区下行的5-HT在PD疼痛中起重要作用。2.免疫荧光结果显示PD疼痛小鼠右侧Vc区5-HT3AR含量增高,在Vc区微量注射Y25130后可减轻PD组小鼠右侧脸颊部痛觉过敏现象,与单纯给与对照剂的PD小鼠比较,机械痛阈值明显增高（p<0.05）。sham小鼠右侧Vc区微量注射SR57227后,出现右侧脸颊痛阈降低,与注射对照剂组比较有显著性差异（p<0.05）。而原位注射AMG9810后,痛阈明显增高,与原位注射生理盐水组相比有显著性差异（p<0.05）。3.免疫荧光和Western blot结果显示,PD疼痛小鼠右侧Vc区TRPV1含量增高,在Vc区微量注射AMG9810后可减轻PD组小鼠右侧脸颊部痛觉过敏现象,与给与对照剂的PD小鼠比较,机械痛阈值明显增高（p<0.05）。且原位注射AMG9810可以减轻SR57227引起的痛觉过敏,与原位注射生理盐水组相比有显著性差异（p<0.05）。说明TRPV1的激活在5-HT调控PD疼痛中起重要作用。结论:RVM区下行的5-HT在Vc区通过结合5-HT3A受体,从而激活TRPV1受体,参与PD相关疼痛的调控。第三部分hAMSCs-VEGF189的构建及其治疗PD小鼠疼痛的实验研究目的:分离、培养原代人脂肪间充质干细胞（hAMSCs）,并通过慢病毒感染的方式将VEGF189基因转入hAMSCs,构建VEGF189基因表达的载体。评估hAMSCs-VEGF189用于治疗PD疼痛的安全性及有效性。方法:首先比较单纯注射VEGF189蛋白和对照剂对PD小鼠Vc区TRPV1和5-HT3A受体的影响。然后采用胶原酶消化法分离培养原代hAMSCs,并将携带VEGF189-GFP基因和携带Vector-GFP基因的慢病毒感染hAMSCs,并利用潮霉素筛选,最后用Western blot方法检测hAMSCs-VEGF189-GFP和hAMSCs-Vector-GFP表达VEGF189的情况。将筛选出的PD疼痛模型小鼠随机分为两组,分别微量注射hAMSCs-VEGF-GFP和hAMSCs-Vector-GFP,观察注射后生物发光活体成像（IVIS）在1-6周内的变化,以及注射后第1周和第6周的疼痛行为学的变化,和注射6周后Vc区TRPV1的改变,SN区DA神经元的数量以及肿瘤相关因子的荧光染色情况。结果:1.单纯使用VEGF189可以明显抑制Vc区TRPV1表达,但是不影响5-HT3A表达。Western blot和免疫荧光结果显示hAMSCs-VEGF-GFP能表达VEGF189,而hAMSCs-Vector-GFP不能表达VEGF189,两者比较存在显著性差异（p<0.05）。且hAMSCs-VEGF-GFP和hAMSCs-Vector-GFP均能表达绿色荧光蛋白GFP。2.IVIS实验显示hAMSCs-VEGF-GFP在小鼠Vc区注射后呈稳步衰减,到第6周时荧光强度明显减低,与第1周相比有显著性差异（p<0.05）。第6周的切片染色结果显示,并无肿瘤相关因子表达,证明AMSCs-VEGF-GFP局部注射无成瘤性,安全可行。3.原位注射hAMSCs-VEGF-GFP后,Vc区TRPV1表达减少。且机械痛痛阈检测显示,hAMSCs-VEGF-GFP注射后PD小鼠右侧脸颊的疼痛阈值显著增高,和hAMSCs-Vector-GFP注射后疼痛阈值相比有显著性差异（p<0.05）。hAMSCs-VEGF-GFP和hAMSCs-Vector-GFP都不影响PD模型小鼠黑质DA神经元数量。结论:VEGF基因经慢病毒感染转入hAMSCs内,在体内体外均可稳定表达VEGF189。hAMSCs-VEGF-GFP原位注射入PD小鼠Vc区不引起肿瘤生长,且其分泌的VEGF189可通过抑制TRPV1表达来提高小鼠机械痛痛阈,并不影响PD疾病本身进程。