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ABA(absicsicacid)是植物体内重要的激素之一,调节植物体内多种生理过程,并在植物响应环境胁迫中起到重要的作用。细胞质游离Ca2+是植物细胞信号转导的最基本的第二信使,几乎介导植物生长发育的所有过程以及众多的胁迫反应。Ca2+在ABA信号转导中起到至关重要的作用。植物体内钙离子的信号能被C a2+受体识别并传递。水稻CCaMK(OsDMI3)已经被显示是Ca2+信号的解码器。在水稻叶片中,OsDMI3被H202、ABA以及PEG处理所活化。结合原生质体瞬时表达体系和突变体料发现,活化的OsDMI3对于ABA诱导的抗氧化防护酶活性的上调和H2O2的积累是必需的。为了更好的研究OsDMI3在ABA诱导的抗氧化防护中的作用,之前实验室利用酵母双杂交系统,以OsDDMI3全长为诱饵筛选水稻叶片cDNA文库寻找其在ABA信号中的互作蛋白,得到了 一个与OsDMI3相互作用的蛋白--过氧化物酶前体蛋白20(Osprx20)。Osprx20为水稻Osprx家族成员之一,加工之后的成熟蛋白属于植物体中的第三类过氧化物酶,其成员功能与维持H202含量稳定有关。但是由于酵母双杂交系统存在较高的假阳性。为了确定这种相互作用的关系又采取了双分子荧光互作(BiFC)技术,GST-pulldown技术以及免疫共沉淀(Co-IP)技术进行了验证。结果证明无论体内和体外OsDMI3都与Osprx20互作。为确定Osprx20参与ABA信号途径,利用了荧光定量PCR技术分析水稻叶片中ABA和H2O2的处理下Osprx20的表达情况。结果显示在ABA和H2O2的处理之下,水稻叶片中Osprx20的表达量出现上升趋势,在ABA处理的过程中,90min时表达量出现了第一个峰值,而H202的处理下,表达量在45min出现了第一个峰值。同时以osdmi3缺失型水稻突变体为材料,检测ABA信号途径中Osprx20的表达。实验表明水稻叶片中OsDMI3缺失会影响ABA诱导的Osprx20的上升。同时,利用体外凝胶激酶反应体系分析显示OsDMI3可以体外磷酸化Osprx20。这些结果表明Osprx20能够被ABA诱导表达,且OsDMI3作用于Osprx20的上游,磷酸化Osprx20。Osprx20属于过氧化物酶家族。为了进一步确定Osprx20在信号通路中的具体作用利用 Amplex(?)Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit 体系对原核表达的Osprx20进行分析,结果证明了体外原核表达的Osprx20能够直接清除H2O2。同时为了明确其在植物体内特别是ABA诱导下的功能是否同体外表达蛋白一致,利用水稻原生质体中瞬时表达和瞬时沉默Osprx20,通过激光共聚焦显微镜观察荧光强度变化以及利用过氧化氩检测试剂盒进行检测。结果表明在水稻原生质体中瞬时表达Osprx20可以降低原生质体中的H2O2含量,瞬时沉默Osprx20则H2O2的含量会明显增加。进一步检测ABA处理瞬时表达和沉默Osprx20的原生质体内H2O2的含量,发现过表达Osprx20能够降低原生质体内ABA诱导的H2O2,Osprx20被干扰的原生质体内ABA诱导的H2O2含量明显高于对照的原生质体。通过这些实验证明Osprx20能够清除水稻叶片中ABA诱导的H2O2。同时,通过对Osprx家族进化树的分析,找到同Osprx20同源性最高的家族蛋白Osprx22,进行基因克隆以及同OsDMI3酵母双杂交的互作实验,发现其家族蛋白和OsDMI3在酵母中不互作。表明OsDMI3与Osprx20相互作用具有一定的特异性。