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本文为了揭示我国甘蔗花叶病病原病毒的多样性,探明各种病原病毒的遗传分化,为抗病毒作物品种培育和病害综合防治提供依据,从我国南方多个地区采集表现花叶症状的糖蔗(hybrid sugarcane,Saccharum interspecific hybrids)、果蔗(noble sugarcane,S.officinarum)、玉米(Zea mays)及2种甘蔗近缘属杂草样品,以病株叶片组织总RNA为模板,采用病毒CP基因特异引物,以一步法RT-PCR对甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)、高梁花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)和甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)等3种病原病毒进行检测。对RT-PCR扩增产物进行直接测序,获得33个SCMV分离物及10个SrMV分离物的近全长CP基因核苷酸序列。
采用序列比对及CP基因系统进化树重建等方法,分别对所有已知CP基因序列的(包括GenBank中已公布的和本研究获得的)SCMV和SrMV分离物进行聚类分析,探明这两种病毒的遗传分化特性。根据GenBank中报道的SCSMV-AP(印度分离物)的已知序列(长4475 bp,登录号Y17738)设计多对引物,对本研究首次鉴定的SCSMV广东分离物(SCSMV-gd)的基因组进行扩增,获得其3端约4.4 kb序列。对SCSMV-gd及目前已报道的其他8个SCSMV分离物进行CP基因序列分析,探明SCSMV的分化和变异情况。对SCSMV-gd的多聚蛋白氨基酸序列进行功能结构域分析,并与马铃薯Y病毒科(Potyviridae)下各个属的部分成员的氨基酸序列进行序列比较和聚类分析,讨论SCSMV在该科中的分类地位。
获得如下研究结果:
田间调查及一步法RT-PCR检测结果表明,华南地区甘蔗普遍受到SCMV(检出率为糖蔗90.0%,果蔗78.1%)或SrMV(检出率为糖蔗46.0%,果蔗34.4%)的侵染,部分植株(糖蔗36.0%,果蔗12.5%)受到这两种病毒的混合侵染,而混合侵染可加重症状表现。RT-PCR检测表明SCSMV在我国存在,目前仅广州某地实验用糖蔗品种C06304上含有SCSMV,该病毒未能在我国田间传播扩散。
共鉴定并获得了33个SCMV分离物的近全长CP基因核苷酸序列,聚类分析结果揭示,目前CP基因序列已知的206个SCMV分离物分化为5个遗传变异类群:糖蔗(SCE)组、玉米(MZ)组、果蔗(NSCE)组、泰国组和巴西组,以及2个独立于各类群之外的特殊株系SCMV-MDB、SCMV-Abaca。其中NSCE组为本研究首次发现。
在5个组中,SCE组内部的分化程度最低,组内各分离物之间的平均CP同一率为95%;泰国组和巴西组内部的分化程度较低,组内平均CP同一率分别为94%和92%:而MZ组和NSCE组内部的分化程度较高,组内平均CP同一率分别为88%和87%。SCE组除了和巴西组之间亲缘关系较近之外,和其他3组及SCMV-MDB、SCMV-Abaca的亲缘关系均较远,表明SCE组是一个在进化过程中独立程度极高的类群。RT-PCR检测及分子鉴定结果表明,在自然条件下SCMV糖蔗组(SCE组)成员可侵染果蔗、玉米和2种甘蔗近缘属杂草:河八王(NaFeriga sp.)、芒(Misca,zthus sp.)。共鉴定并获得了10个SrMV分离物的近全长CP基因核苷酸序列,聚类分析结果表明,目前CP基因序列已知的22个SrMV分离物分化为2个遗传变异类群,分别对应于各自的寄主来源,故命名为糖蔗(SH)组和果蔗(SO)组。SH组内部和SO组内部各分离物之间的平均CP同一率均为90%,而2组之间的平均CP同一率为80%。
获得了SCSMV广东分离物(SCSMV-gd)的基因组3,端4369 nt序列。SCSMV-gd与印度分离物SCSMV-AP之间的核苷酸序列同一率为82.9%,推导氨基酸序列同一率为93%。CP基因序列分析揭示SCSMV-gd与SCSMV巴基斯坦分离物的亲缘关系最近,二者的CP基因核苷酸和氨基酸同一率分别为89.7%和97.8%。
序列分析显示,SCSMV-gd的NIb氨基酸序列中含有依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP) 的活性位点基序 GgpSGQPSTvvd-NTX<,26>-GDD,与马铃薯Y病毒科通常所含有的RdRP活性位点基序略有不同,该基序的第2和第3位氨基酸残基发生了突变(NN→GP)。对SCSMV和马铃薯Y病毒科各个属的部分成员进行氨基酸序列比较、同一率计算和聚类分析,结果表明:与具有蚜传特性的马铃薯Y病毒科成员相比,SCSMV的CP N-端区域存在较严重的缺失而且不具蚜传相关基序DAG,由此推测SCSMV不具有蚜传特性;SCSMV与马铃薯Y病毒科各个属之间的平均CP氨酸同一率为25%~37%,且在进化树中独立于各个属而存在,故该病毒应代表该科下的一个新属。