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狼疮性肾炎(lupus nephrits,LN)是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)最严重和最常见的并发症之一,长期重度蛋白尿是狼疮性肾炎的主要临床表现,也是预后不良的标志。在蛋白尿形成的各种机制中,足细胞功能障碍或损伤是重要的原因。因此探明狼疮性肾炎足细胞损伤的具体机制,预防或改善蛋白尿,缓解患者肾损伤是临床亟待解决的关键问题。本研究以狼疮性肾炎患者、狼疮性肾炎MRL/lpr模型小鼠和体外培养永生化小鼠足细胞为研究对象,探明nestin在狼疮性肾炎足细胞损伤及蛋白尿产生中的作用及其可能机制,为进一步阐明狼疮性肾炎的发病机制及其靶向治疗提供依据。具体实验分为以下四部分:第一部分Nestin通过调节足细胞nephrin表达参与狼疮性肾炎蛋白尿的形成目的:探讨nestin蛋白在狼疮性肾炎足细胞损伤及蛋白尿产生中的作用及其可能机制。方法:1.收集狼疮性肾炎活检肾组织和因肾肿瘤手术切除的远端正常肾组织,根据平均蛋白尿水平将LN患者分为轻度蛋白尿组(LN-MP)和重度蛋白尿组(LN-SP),采用免疫荧光和免疫组织化学方法检测足细胞nestin、synaptopodin和nephrin的表达。2.30周龄雌性MRL/lpr小鼠依据平均蛋白尿水平随机分为轻度蛋白尿组(MRL/lpr-MP)和重度蛋白尿组(MRL/lpr-SP),同周龄、同性别MRL/MPJ小鼠作为对照组,每组10只小鼠。留取血、尿标本后处死小鼠,收集双侧肾脏组织。酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠尿蛋白水平,免疫组织化学和Western blot方法检测小鼠肾皮质nestin、nephrin和p-nephrin(Y1217)的表达。3.以分化成熟小鼠足细胞为研究对象,检测狼疮性肾炎环境下nestin蛋白的表达及其对nephrin蛋白表达及磷酸化的影响:⑴观察狼疮性肾炎患者置换血浆(LN plasma)对足细胞nestin、nephrin和p-nephrin(Y1217)蛋白表达的影响:10%LN plasma刺激足细胞0、12、24、36、48 h后收集细胞,Western blot方法检测nestin、nephrin以及p-nephrin(Y1217)蛋白的表达。⑵观察nestin对足细胞nephrin蛋白表达及磷酸化的影响:敲低或过表达足细胞nestin后,给予健康人或狼疮性肾炎患者置换血浆刺激24 h,收集细胞,使用Western blot方法检测nestin、nephrin以及p-nephrin(Y1217)蛋白的表达。结果:1.狼疮性肾炎时肾小球足细胞中nestin与nephrin蛋白表达呈正相关,且二者均与蛋白尿呈负相关⑴免疫荧光结果显示,与control组相比,LN-MP组患者肾小球足细胞nestin表达增多;而与LN-MP组相比,LN-SP组患者肾小球足细胞中nestin表达明显降低。免疫组织化学结果显示,与control组相比,nestin与nephrin蛋白在LNⅣ与LNⅤ型患者肾组织连续切片同一肾小球足细胞中均表达减少,检测二者在同一肾小球表达呈正相关,同时与蛋白尿水平均呈负相关。⑵免疫组化结果显示,MRL/lpr小鼠肾组织连续切片,同一肾小球中足细胞nestin与nephrin蛋白表达呈正相关,并且二者均与小鼠24 h蛋白尿水平呈负相关。Western blot结果显示,与MRL/MPJ组相比,MRL/lpr-MP组小鼠肾皮质nestin、nephrin与p-nephrin(Y1217)蛋白表达明显升高;而与MRL/lpr-MP组相比,MRL/lpr-SP组小鼠肾皮质nestin、nephrin与p-nephrin(Y1217)蛋白表达明显降低。2.足细胞nestin可调控nephrin蛋白的表达及磷酸化⑴LN plasma可上调足细胞nestin、nephrin与p-nephrin(Y1217)蛋白表达:Western blot结果显示,LN plasma刺激小鼠足细胞24 h时nestin、nephrin与p-nephrin(Y1217)蛋白表达明显上调。⑵Nestin可调控足细胞nephrin蛋白的表达及磷酸化水平:Western blot结果显示,与control plasma组相比,LN plasma组nestin、nephrin与p-nephrin(Y1217)蛋白表达明显增加,而nephrin与p-nephrin(Y1217)蛋白在敲低nestin表达后表达明显降低,过表达nestin后表达上调更为明显。结论:Nestin通过调控nephrin的表达及磷酸化水平参与了狼疮性肾炎足细胞损伤,介导蛋白尿形成。第二部分Nestin通过改变狼疮性肾炎足细胞内线粒体自噬水平调节nephrin的表达目的:分析nestin与线粒体自噬的关系,探讨nestin与线粒体自噬在狼疮性肾炎足细胞损伤以及蛋白尿形成中的作用。方法:1.收集第一部分临床与动物实验标本,免疫荧光双染方法检测足细胞nestin与LC3、p62蛋白的表达及共定位;透射电镜检测小鼠肾小球足细胞超微结构。2.以分化成熟小鼠足细胞为研究对象,检测狼疮性肾炎环境下nestin与线粒体自噬的关系,及二者对足细胞损伤的影响:⑴观察LN plasma对足细胞自噬的影响:10%LN plasma刺激足细胞0、12、24、36、48 h后,m RFP-GFP-LC3质粒观察自噬流,细胞免疫荧光和Western blot方法检测atg5、atg12、atg16、LC3、p62以及PINK1蛋白的表达。⑵检测抑制自噬对狼疮性肾炎足细胞nestin蛋白表达以及nephrin表达及磷酸化的影响:将已分化足细胞随机分为control plasma组、LN plasma组、LN plasma+3-MA组、LN plasma+si PINK1组和LN plasma+si NC组,Western blot方法检测atg5、atg12、atg16、LC3、p62和PINK1等自噬相关蛋白的表达以及nestin、nephrin、p-nephrin(Y1217)蛋白的表达。⑶检测nestin对狼疮性肾炎足细胞自噬的影响:细胞分组同第一部分,Western blot方法检测敲低或过表达nestin后足细胞atg5、atg12、atg16、LC3、p62以及PINK1蛋白的表达。结果:1.狼疮性肾炎轻度蛋白尿时足细胞自噬水平升高⑴透射电镜观察可见,在MRL/lpr-MP组小鼠足细胞内有大量自噬小体,足突有轻微融合;而在MRL/lpr-SP组小鼠足细胞中自噬小体数量减少,足突融合严重。⑵免疫荧光结果显示,与MRL/MPJ组相比,MRL/lpr-MP组小鼠肾小球nestin、LC3表达增加,p62表达减少,同时nestin与LC3共定位增加;而与MRL/lpr-MP组相比,MRL/lpr-SP组小鼠肾小球nestin与LC3表达下调,p62表达增加,同时nestin与LC3共定位减少。同样,与control组相比,LN-MP组患者肾小球nestin与LC3表达增加,并且共定位增加;而与LN-MP组相比,LN-SP组患者肾小球nestin与LC3表达显著降低,二者共定位减少。2.Nestin可通过调节狼疮性肾炎足细胞自噬水平来影响nephrin蛋白的表达及磷酸化水平⑴LN plasma可上调足细胞自噬水平:足细胞转染m RFP-GFP-LC3质粒,LN plasma刺激足细胞24 h时自噬流增强;且细胞免疫荧光与Western blot结果显示,LN plasma刺激足细胞24 h时atg5、atg12、atg16、LC3与PINK1表达明显升高,p62蛋白表达显著下降。⑵抑制足细胞自噬可下调nephrin蛋白表达及磷酸化:Western blot结果显示,使用3-MA抑制自噬后nephrin和p-nephrin(Y1217)表达明显下调,而nestin表达没有改变;敲低PINK1表达后,nephrin和p-nephrin(Y1217)蛋白表达明显下调,但不影响nestin蛋白表达。⑶Nestin可调控足细胞自噬水平:Western blot结果显示,与control plasma组相比,LN plasma组nestin、atg5、atg12、atg16、PINK1和LC3蛋白表达明显增加,p62蛋白表达明显下降,敲低nestin表达后atg5、atg12、atg16、PINK1和LC3蛋白表达下调,p62表达有所恢复;而过表达nestin后,atg5、atg12、atg16、PINK1和LC3表达明显上调,p62表达下降。结论:狼疮性肾炎时nestin可通过调控足细胞自噬水平来影响nephrin蛋白的表达及磷酸化。第三部分Nestin通过改变狼疮性肾炎足细胞氧化应激水平调节nephrin的表达目的:分析nestin、nephrin、线粒体自噬与氧化应激的关系,探讨氧化应激在狼疮性肾炎足细胞损伤中的作用。方法:以分化成熟小鼠足细胞为研究对象,检测氧化应激与nestin、自噬、nephrin的关系,分析其对狼疮性肾炎足细胞损伤的影响:⑴观察LN plasma对足细胞氧化应激及PTP1B、fyn蛋白表达的影响:10%LN plasma刺激足细胞0、12、24、36、48 h后,Mito SOX Red染色、流式细胞术检测足细胞内ROS含量,Western blot方法检测PTP1B、fyn蛋白的表达。⑵检测抗氧化剂NAC以及Mito-TEMPO对LN plasma诱导足细胞nestin、nephrin、PTP1B蛋白表达及自噬的影响:将分化成熟足细胞随机分为control plasma组、LN plasma组、LN plasma+NAC组、LN plasma+Mito-TEMPO组和LN plasma+DMSO组,Western blot方法检测nestin、nephrin、p-nephrin、LC3、p62、PINK1以及PTP1B蛋白的表达。⑶检测抑制自噬对LN plasma诱导的足细胞氧化应激水平及PTP1B表达的影响:细胞分组同第二部分,采用Mito SOX Red染色、流式细胞术检测足细胞内ROS含量,Western blot检测PTP1B蛋白的表达。⑷检测nestin对LN plasma诱导足细胞氧化应激水平以及PTP1B、fyn蛋白表达的影响:细胞分组同第一部分,Mito SOX Red染色、流式细胞术检测足细胞内ROS含量,Western blot方法检测PTP1B和fyn蛋白的表达。⑸检测PTP1B inhibitor以及SU6656对LN plasma诱导足细胞nephrin磷酸化水平的影响:将已分化足细胞随机分为control plasma组、LN plasma组、LN plasma+PTP1B inhibitor组,LN plasma+SU6656组和LN plasma+DMSO组,Western blot检测PTP1B、fyn、nephrin和p-nephrin蛋白的表达。结果:1.狼疮性肾炎足细胞氧化应激与自噬可相互影响,并且受nestin调控⑴LN plasma可调节足细胞ROS水平:流式细胞术与Mito SOX染色结果显示,LN plasma刺激足细胞12、24、36 h后ROS表达水平减少,48 h后ROS水平增加。⑵抗氧化剂可下调LN plasma诱导的足细胞自噬水平:Western blot结果显示,抗氧化剂NAC与Mito-TEMPO可明显下调LC3、PINK1蛋白表达,恢复p62表达,而对nestin表达没有影响。⑶抑制自噬可下调LN plasma诱导的足细胞ROS产生:流式细胞术与Mito SOX染色结果显示,与control plasma组相比,LN plasma组足细胞ROS产生减少,3-MA抑制足细胞自噬后ROS产生减少更明显。⑷Nestin可调节LN plasma诱导足细胞ROS的产生:流式细胞术与Mito SOX染色结果显示,与control plasma组相比,LN plasma组足细胞ROS产生减少,敲低nestin表达后足细胞ROS产生减少更为明显,而过表达nestin后ROS产生增加。2.Nestin可通过调节狼疮性肾炎足细胞氧化应激水平来介导PTP1B/fyn平衡,从而影响nephrin蛋白的表达及磷酸化水平⑴LN plasma可上调足细胞PTP1B和fyn表达:Western blot结果显示,LN plasma刺激足细胞24 h时PTP1B和fyn表达均明显升高。⑵抑制PTP1B或fyn表达会上调或下调LN plasma诱导的足细胞nephrin蛋白磷酸化及表达水平:Western blot结果显示,与control plasma组相比,LN plasma组PTP1B、fyn、nephrin和p-nephrin(Y1217)蛋白表达明显升高,抑制PTP1B表达后nephrin和p-nephrin(Y1217)蛋白表达明显上调,使用抑制剂SU6656抑制fyn表达后,nephrin和p-nephrin(Y1217)蛋白表达均明显下调。⑶抗氧化剂可上调LN plasma诱导的足细胞PTP1B蛋白表达,并下调nephrin、p-nephrin(Y1217)表达:Western blot结果显示,与control plasma组相比,LNplasma组PTP1B、nephrin、p-nephrin(Y1217)蛋白表达升高,而抗氧化剂NAC与Mito-TEMPO预处理足细胞后PTP1B表达升高更明显,nephrin和p-nephrin(Y1217)表达下调。⑷抑制自噬可上调LN plasma诱导的足细胞PTP1B蛋白表达:Western blot结果显示,与control plasma组相比,LN plasma组PTP1B表达上调,而3-MA抑制足细胞自噬或si PINK1抑制线粒体自噬后PTP1B蛋白上调更为明显。⑸敲低nestin表达可下调LN plasma诱导的足细胞fyn蛋白的表达,并上调PTP1B表达:Western blot结果显示,与control plasma组相比,LN plasma组nestin、PTP1B、fyn蛋白表达明显增加,而敲低nestin表达后fyn蛋白表达明显降低,PTP1B表达升高。结论:狼疮性肾炎时nestin可通过调控足细胞氧化应激水平来打破PTP1B/fyn的平衡,从而影响nephrin蛋白的表达及磷酸化水平。第四部分敲低nestin表达加重MRL/lpr小鼠足细胞损伤及蛋白尿水平目的:本研究拟以狼疮性肾炎模型MRL/lpr小鼠为研究对象,活体感染病毒技术沉默肾脏nestin基因表达,观察肾小球足细胞损伤及蛋白尿水平,同时检测足细胞nephrin蛋白磷酸化及表达水平,探讨nestin在狼疮性肾炎蛋白尿形成中的作用及其可能机制。方法:18只27周龄雌性MRL/lpr小鼠随机分为MRL/lpr组,MRL/lpr-sh NC-Ad组和MRL/lpr-sh Nestin-Ad组,双侧肾脏原位注射腺病毒;并选取6只同周龄、同性别MRL/MPJ小鼠作为对照组,双侧肾脏原位注射等量生理盐水。3周后留取血、尿标本后处死小鼠,收集双侧肾脏组织。免疫荧光、real-time PCR观察质粒转染效率及沉默效果,ELISA方法检测小鼠尿蛋白,HE、PAS染色及透射电镜进行病理形态学观察,免疫组织化学和Western blot方法检测小鼠肾皮质nestin、nephrin、p-nephrin(Y1217)、LC3和p62蛋白的表达。结果:1.腺病毒感染技术可有效敲低MRL/lpr小鼠肾皮质nestin的表达荧光显微镜观察冰冻切片显示,MRL/lpr小鼠肾脏原位注射腺病毒3周后,每只小鼠肾皮质均有荧光表达。Real-time PCR结果显示,与MRL/MPJ组小鼠相比,MRL/lpr组小鼠肾皮质nestin m RNA表达水平明显增加,原位注射腺病毒小鼠肾皮质nestin m RNA表达水平明显降低。2.敲低肾组织中nestin表达会加重MRL/lpr小鼠蛋白尿水平,加重肾损伤⑴ELISA检测显示,与MRL/MPJ组小鼠相比,MRL/lpr组小鼠24 h蛋白尿水平明显增加;而与MRL/lpr+sh NC组相比,MRL/lpr+sh Nestin组小鼠24 h蛋白尿水平显著增加。⑵HE与PAS染色显示,与MRL/MPJ组小鼠相比,MRL/lpr组小鼠肾小球体积增大,并且系膜区增宽,细胞数增多,基质沉积明显;与MRL/lpr+sh NC组小鼠相比,MRL/lpr+sh Nestin组小鼠肾小球病理改变更为明显,系膜区基质沉积增多。⑶透射电镜观察可见,MRL/MPJ组小鼠足细胞结构正常,足突呈拉链样,在MRL/lpr组小鼠足突轻微融合,而MRL/lpr+sh Nestin组小鼠足突融合严重,基底膜呈不规则增厚。3.敲低MRL/lpr小鼠肾组织中nestin表达会下调nephrin、p-nephrin(Y1217)表达及自噬水平⑴免疫组化结果显示,与MRL/lpr组小鼠相比,MRL/lpr组小鼠肾小球足细胞nestin、nephrin、LC3蛋白表达增加,p62蛋白表达减少,而MRL/lpr+sh Nestin组小鼠肾小球足细胞nestin、nephrin、LC3蛋白表达减少,p62蛋白表达有所恢复。⑵Western blot结果显示,与MRL/MPJ组小鼠相比,MRL/lpr组小鼠肾皮质nestin、nephrin与p-nephrin(Y1217)蛋白表达明显增加,而MRL/lpr+sh Nestin组小鼠肾皮质nestin、nephrin与p-nephrin(Y1217)蛋白表达明显降低。结论:敲低MRL/lpr小鼠足细胞nestin蛋白表达,可下调足细胞nephrin表达及磷酸化水平以及自噬水平,加重小鼠蛋白尿水平。