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自从1997年香港发生禽流感,H5N1亚型高致病性禽流感已经引发东南亚许多国家的养禽业遭受了重大损失,并且陆续出现了禽流感感染人的事件。研究表明,该病毒的谱系已悄然发生改变,病毒的不同病原特性使其感染的宿主范围在不断扩大,特别是针对哺乳动物的感染。在禽流感肆虐养禽业期间,泰国发生了H5N1亚型禽流感病毒感染犬事件,血清学检测也发现629只泰国本地犬能检测到H5特异抗体。这意味着该病毒很有可能感染犬,但是有研究发现H5N1亚型流感病毒感染犬的效果不佳,感染后出现轻微临床症状,几乎无病理损伤。因此,关于H5N1亚型流感病毒感染犬尚未有定论。为了阐明流感病毒对犬的易感性,本研究用我国青海湖分离到2.2谱系代表毒株A/bar-headed goose/Qinghai/3/05(BHG/QH/3/05),分别通过滴鼻和气管接种两种途径感染12只比格犬,每组6只。感染结果发现犬出现厌食、发烧、结膜炎、呼吸急促和咳嗽等症状,其中一只气管接种的犬(B10)于感染后的第4天死亡。通过EID50检测发现病毒在上呼吸道和下呼吸道都有复制,滴鼻组的6只犬和气管接种组的1只犬可以通过鼻腔排毒;3d.p.i.和5d.p.i.剖杀后以及4d.p.i.死亡的犬只体内,发现病毒在肺脏复制。结果表明, H5N1亚型禽流感病毒对犬是高度易感的,并且可以通过鼻腔向外排毒。一旦犬可以作为流感感染的的中间宿主,将对人类的健康构成重大威胁。为探索治疗禽流感的方法,本实验采用噬菌体展示技术筛选出具有抗原结合活性的抗体可变区片段,作为下一步人源化抗体的供体骨架区。首先从免疫H5N1亚型禽流感疫苗的猕猴淋巴细胞中提取总mRNA并扩增重链和轻链可变区(VH、Vλ和Vκ),用重叠延伸PCR方法构建VH-Linker-Vλ和VH-Linker-Vκ形式的单链抗体(scFv),展示在噬粒表面,并在E.coil TG1中形成了噬菌体抗体库,从2.2×106的噬菌体库中淘选得到具有较高亲和力的L11株scFv,并通过ELISA、SDS-PAGE、Western-blot、间接免疫荧光(IFA)和竞争抑制ELISA对其进行鉴定,证实所获得的scFv大小为32kD,并且能与病毒发生特异性结合。IgBlast序列分析发现,所得到的scFv基因Vλ与人免疫球蛋白胚系基因同源性达91.5%,而VH同源性为75%。为了进一步研制有活性的人源化抗体,本研究构建了鼠源人源化抗体的真核表达载体。鼠源可变区抗体基因片段是从分泌抗HA的单克隆抗体的杂交瘤细胞中获得,利用IgBlast进行序列比对分析,鼠源的重链和轻链可变区基因与胚系基因核苷酸同源性最高分别达到92.2%和93.6%。确认该片段的互补决定区后,将其进行人源化改变,保留了鼠源CDRs区域,替换VH和VL片段中的部分氨基酸,尽可能消除其对人的免疫原性,通过DNA合成技术将合成好的人源化重链和轻链克隆到pOptiVEC和pcDNA3.3载体中,转染到CHO-dhfr-细胞系中瞬时表达,并通过二氢叶酸还原酶加压筛选系统。结果表明,所构建的载体能够表达得到的全抗体片段。该方法为以后进一步得到不同人源化抗体打下良好基础。