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目的应用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术,对重型再生障碍性贫血(Severe Aplastic Anemia,SAA)患者与正常人骨髓CD34+细胞的蛋白质成分进行分析,获得SAA骨髓CD34+细胞疾病特异性的蛋白质组差异表达图谱,初步筛选导致SAA免疫功能亢进的自身抗原,为进一步阐明SAA免疫发病机制提供理论依据。通过检测SAA患者外周血血清白介素(IL)-17水平,分析其与T淋巴细胞亚群、树突细胞(DC)亚群、调节性T细胞(Treg)以及血常规之间相关性,初步探讨IL-17与SAA的关系,为寻找新的SAA治疗方法提供理论依据。方法研究对象为天津医科大学总医院血液科自2013年1月至2014年2月收治的初治SAA患者、治疗后恢复期的SAA患者及正常对照者。第一部分建立SAA骨髓CD34+细胞差异蛋白质表达图谱,应用免疫磁珠法分选29例SAA恢复期患者及10名健康正常人骨髓CD34+细胞,提取总蛋白并将蛋白质酶解,应用iTRAQ试剂标记样品,应用多维液相色谱分离样品并串联质谱Q Exactive进行蛋白质分析,应用数据库检索鉴定蛋白质,并比较这些蛋白质的表达差异,初步探索导致SAA免疫功能亢进的抗原物质。第二部分探讨白介素IL-17在SAA患者发病机制中的作用,采用流式液相多重蛋白定量技术(CBA)检测25例SAA初治患者、15例SAA恢复期患者及10名健康正常人外周血血清IL-17水平,同时应用单克隆抗体标记及流式细胞术检测T细胞亚群(CD4+/CD8+比值)、DC(髓样树突细胞/淋系树突细胞比值,mDC/pDC比值)、调节性T细胞(Treg)比例,分析血清IL-17水平与T亚群、DC亚群、Treg比例及血常规相关性。结果第一部分获得SAA骨髓CD34+细胞的蛋白质组差异表达图谱。以蛋白质置信度>95%及鉴定肽段蛋白质假阳性率<1%为限,共鉴定肽段15120个,蛋白3208个。以差异蛋白Ratio(病例组/对照组)大于2.794和小于0.323并且置信度>95%为限,共筛选出高可信的差异蛋白157个,其中上调蛋白54个,下调蛋白103个。差异蛋白涉及的生理功能包含以下几方面：细胞凋亡、细胞周期、RNA剪接及代谢、蛋白质修饰及转运、泛素-蛋白酶体系统介导的蛋白质降解等。第二部分SAA初治组IL-17水平为17.07±15.18pg/ml,明显高于恢复组(7.09±3.84pg/ml,P<0.01)和对照组(3.53±2.08pg/ml, P<0.01); SAA’恢复组IL-17水平亦明显高于对照组(P<0.05)。初治组CD4+/CD8+比值为0.32±0.08明显低于恢复组(1.11±0.31,P<0.01)及对照组(1.07±0.26,P<0.01)；初治组mDC/pDC比值为3.16±0.55明显高于恢复组(1.6±0.43,P<0.01)及对照组(1.43±0.38,P<0.01)；初治组Treg占外周血单个核比例(CD4+CD25+CD127dim/PBL)为0.8±0.31%明显低于恢复组(1.78±0.69%,P<0.01)及对照组(2.23±0.66%,P<0.01)。初治组IL-17水平和CD4+/CD8+比值及CD4+CD25+CD127dim/PBL均呈负相关(r=-0.421,P<0.05；r=-0.65,P<0.01)；与mDC/pDC比值呈正相关(r=0.414,P<0.05)；与白细胞水平呈负相关(r=-0.689,P<0.01)；恢复组IL-17水平与白细胞水平呈负相关(r=-0.64,P<0.05)。结论1.成功获得了SAA患者骨髓CD34+细胞的蛋白质组差异表达图谱,并且证明iTRAQ标记串联质谱技术用于SAA患者骨髓细胞的差异蛋白质组学分析是一种有效的方法。本次差异蛋白质组学研究发现157个在SAA骨髓CD34+细胞中表达异常的蛋白质,差异蛋白功能主要涉及细胞凋亡、细胞周期、蛋白质修饰及转运、RNA处理及剪接、泛素-蛋白酶体系统等方面。初步预测了可能导致SAA免疫“瀑布”激活的抗原物质。2.SAA患者血清IL-17水平明显升高,经ATG、环孢素A等强化免疫治疗后IL-17水平明显下降但仍高于正常水平。并且SAA患者血清IL-17水平与免疫功能状态及病情严重程度相关。IL-17有可能成为SAA治疗的新靶点,及评估SAA病情、疗效及预后的指标。