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研究背景:近年来,核能与辐射技术已经广泛应用于民用、医疗及军事领域,核能在给人类带来巨大福利的同时,也为人类的健康带来了巨大的威胁与挑战。电离辐射导致的放射性损伤已经成为国民经济、社会发展和国防建设中迫切需要解决的关键科技问题之一。深入研究和探索辐射损伤防护新靶点,研制新型高效的辐射损伤防护剂具有重要的意义。2008年Science主刊首次报道TLR5激动剂CBLB502在动物体内具有明显的辐射防护作用,使得TLR及其TLR相关配体在电离辐射防护研究领域得到了越来越多的关注,此后科学家们相继发现靶向激活TLR2/TLR4/TLR9均具有明显的辐射防护效果。我们前期通过对TLR及其相关配体进行大量预实验筛选,并最终筛选得到一种新型TLR配体Zymosan-A,Zymosan-A又称酵母多糖,是一类通过β-1,3糖苷键连接的葡聚糖,预实验结果表明其具有明显的辐射防护效果。在本课题中,我们开展了Zymosan-A的辐射防护作用及其初步机制的研究。本研究课题中主要分为三个部分,分别是Zymosan-A的急性毒性实验研究,Zymosan-A的辐射防护效应研究和Zymosan-A的辐射防护效应初步机制探索。研究目的:1.系统性研究Zymosan-A对在体动物,辐射敏感组织和体外细胞的辐射防护效应。2.对Zymosan-A的辐射防护作用机制进行初步探索,试图筛选潜在辐射防护新靶点。研究方法:1.Zymosan-A溶解。Zymosan-A购买自Sigma公司,采用生理盐水溶解配制不同浓度梯度溶液。2.Zymosan-A的急性毒性实验。（1）采用小鼠体内急性动物实验,经腹腔注射给予小鼠不同剂量梯度Zymosan-A,连续观察其10天生存期,评价Zymosan-A对整体动物的急性毒性。（2）采用CCK-8细胞活力检测方法,给予不同细胞不同浓度梯度Zymosan-A刺激24小时后,采用酶标仪检测细胞活力的变化。3.Zymosan-A的辐射防护效应研究。（1）小鼠急性放射损伤模型的建立。采用本教研室设计的C57BL/6小鼠固定模型固定小鼠,使用海军军医大学辐照中心60Co Gamma射线源对小鼠进行大剂量单次Gamma射线照射,制备小鼠急性放射性损伤模型。（2）Zymosan-A对整体动物的防护效应。对小鼠进行不同剂量单次Gamma射线照射后计算照后小鼠生存率及平均存活时间,绘制生存曲线评价Zymosan-A对整体动物的防护效应。（3）Zymosan-A对体外细胞的防护效应。照后24小时采用CCK-8实验和流式细胞术检测受照细胞的细胞活力和细胞凋亡率,评价Zymosan-A对体外细胞的防护效应。（4）Zymosan-A对受照小鼠辐射敏感组织的防护效应。采用动物血细胞分类计数仪检测受照小鼠外周血白细胞数目变化;采用流式细胞术检测受照小鼠骨髓有核细胞数目变化和凋亡情况;采用称量方式计算受照小鼠脾脏脏器指数;采用病理HE染色方法检测受照小鼠骨髓微结构、血窦出血等情况。4.新型TLR配体Zymosan-A辐射防护初步机制探讨。（1）采用TLR2/4基因敲除小鼠初步验证Zymosan-A的防护机制。对TLR2,TLR4基因敲除小鼠进行大剂量单次Gamma射线照射,计算照后基因敲除小鼠生存率及平均存活时间,绘制生存曲线。（2）Zymosan-A对受照小鼠体内辐射防护细胞因子的调控作用。对小鼠进行大剂量单次Gamma射线照射后,通过酶联免疫吸附实验检查照后小鼠体内辐射防护细胞因子的表达水平。（3）Zymosan-A对受照小鼠骨髓原代细胞的凋亡抑制作用。对小鼠进行大剂量单次Gamma射线照射24小时后,采用流式细胞术检测小鼠骨髓原代细胞的凋亡水平的变化。（4）Zymosan-A对受照小鼠骨髓原代细胞胞内细胞因子的表达水平作用。对小鼠进行大剂量单次Gamma射线照射24小时后,通过流式细胞胞内细胞因子染色技术检测骨髓原代细胞胞内GM-CSF,G-CSF,IL-12和IL-6的表达水平变化。（5）Zymosan-A对受照小鼠造血干细胞的辐射防护作用。对小鼠进行大剂量单次Gamma射线照射,照后24小时用流式细胞术检测造血干细胞的比例变化。（6）Zymosan-A对DNA损伤反应的影响。对AHH-1进行Zymosan-A药物刺激后进行单次Gamma射线照射后,检测γ-H2AX foci的形成以评价Zymosan-A对照射引起DNA损伤双链断裂的影响。（7）RNA-SEQ方法鉴定Zymosan-A辐射防护的新效应分子及信号通路。照射前24小时和2小时采用腹腔注射的方式给予C57BL/6小鼠Zymosan-A,随后对小鼠进行大剂量单次Gamma射线照射,照后24小时取小鼠骨髓原代细胞,裂解红细胞后提取RNA进行RNA-SEQ。随后计算基因表达量并分析样品间差异表达基因,并对差异基因进行热图分析,GO分析和KEGG生物通路富集分析。研究结果:1.新型TLR配体Zymosan-A的急性毒性实验（1）小鼠体内急性毒性实验。通过小鼠体内急性毒性实验计算得出Zymosan-A药物半致死剂量约为666.7 mg/kg,而试验中每只小鼠最佳给药剂量为25/kg mg+25mg/kg,远低于其药物半致死剂量。（2）体外细胞急性毒性实验。试验中细胞最佳给药剂量为40μg/ml,远低于药物致死剂量。2.新型TLR配体Zymosan-A的辐射防护效应研究。（1）小鼠急性放射损伤模型的建立。采用本教研室设计的C57BL/6小鼠固定模型固定小鼠,使用海军军医大学辐照中心60Co源对小鼠进行单次大剂量Gamma射线照射,制备小鼠急性放射性损伤模型。（2）Zymosan-A对整体动物的辐射防护损伤效应。生存期实验结果发现在多个剂量照射条件下,照射给药组较单纯照射组小鼠生存率明显提高;平均存活时间明显延长。（3）Zymosan-A对体外细胞的辐射损伤防护效应。CCK-8和流式细胞术实验结果表明给药组较单纯照射组细胞活力明显提高,照后24小时凋亡率明显下降。（4）Zymosan-A对受照小鼠辐射敏感组织的防护效应。实验结果表明给药照射组较单纯照射组外周血白细胞数目明显增加;骨髓有核细胞数目明显增加,凋亡率明显下降;照射给药组较单纯照射组其脾指数明显增加;骨髓病理HE染色结果表明照射给药组较单纯照射组,其血窦结果破坏轻微,出血量少,蓝染有核细胞明显增加,且骨髓损伤修复速度明显高于单纯照射组。5.新型TLR配体Zymosan-A辐射防护初步机制探讨。（1）采用TLR2/4基因敲除小鼠初步验证Zymosan-A的辐射损伤防护机制。基因敲除小鼠生存期结果表明TLR2和TLR4基因敲除小鼠的辐射敏感性较野生型小鼠辐射敏感性增加,Zymosan-A对TLR4基因敲除小鼠发挥了明显的辐射防护效果,而TLR2基因敲除后逆转了Zymosan-A的辐射防护作用。（2）Zymosan-A对受照小鼠体内辐射防护细胞因子的调控作用。照前给予C57BL/6小鼠Zymosan-A刺激后,照后检测小鼠体内辐射防护细胞因子表达水平变化,结果表明给药组较单纯照射组,小鼠体内IL-6,IL-11,IL-12,TNF-α的水平明显上调。（3）Zymosan-A对受照小鼠造血干细胞的辐射防护作用。照前给予C57BL/6小鼠Zymosan-A刺激后,照后通过流式细胞术检测小鼠造血干细胞变化发现证实Zymosan-A可以促进造血干细胞向造血祖细胞分化。（4）Zymosan-A对DNA损伤反应的影响。γ-H2AX foci结果表明Zymosan-A明显减少电离辐射后γ-H2AX foci的形成。（5）RNA-SEQ方法鉴定Zymosan-A辐射防护的新效应分子及信号通路。通过高通量二代测序共筛选出131个显著差异基因,其中30个显著上调基因,101个显著下调基因,之后对显著差异基因进行热图分析,GO分析和KEGG分析,分析结果证实Zymosan-A的辐射防护作用主要通过调节照后小鼠体内的免疫反应进程发挥电离辐射防护作用。研究结论:1.Zymosan-A对在体小鼠和体外细胞的最佳电离辐射防护剂量远低于其毒性剂量,成为潜在辐射防护剂的可能性高。2.Zymosan-A对在体小鼠,辐射敏感组织和体外细胞三个层面均发挥了明显的辐射防护作用。3.通过基因敲除小鼠证实Zymosan-A主要通过靶向激活TLR2信号通路,上调辐射防护因子IL-6,IL-11,IL-12,TNF-α,调节照后小鼠体内的免疫反应发挥电离辐射防护作用。此外,Zymosan-A也可以减少受照小鼠骨髓原代细胞凋亡,增加受照小鼠骨髓造血系统造血干细胞向造血祖细胞分化比例,减少电离辐射后DNA双链断裂。