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目的:体外表达异亮氨酸拉链（ILZ）修饰的hsGITRLaa52-177重组蛋白（ILZ-hsGITRL）,并初步鉴定ILZ-hsGITRL重组蛋白的结构特征和生物学活性。方法:（1）应用.PCR技术,以hGITRL-TA质粒为模板,扩增获得hGITRLaa52-177基因,在其N端融合化学合成的异亮氨酸拉链基序（Isoleucine zipper,ILZ）,获得ILZ-hsGITRL重组基因,通过BamHⅠ、HindⅢ双酶切PCR产物和原核表达质粒PET32a（+）,连接酶切产物,转化至感受态E.coli DH5α;选择阳性菌株,抽提重组质粒,进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切、PCR和基因测序鉴定。同时构建表达质粒PET32a（+）-hsGITRLaa52-177,与表达质粒PET32a（+）-ILZ-hsGITRLaa52-177,分别转化ROS表达工程菌,利用IPTG诱导蛋白表达。（2）初次表达的重组蛋白为Trax-hsGITRL和Trax-ILZ-hsGITRL蛋白,分别通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。通过Ni+-IMAC柱分别对Trax-hsGITRL和Trax-ILZ-hsGITRL蛋白进行纯化。根据肠激酶的操作手册,对纯化的Trax-hsGITRL和Trax-ILZ-hsGITRL蛋白进行酶切,酶切后的蛋白分别再次通过Ni+-IMAC柱,Trax部分因含有His标签结合到Ni+-IMAC柱上,穿透峰蛋白即为纯化的hsGITRL或ILZ-hsGITRL蛋白。通过ELISA法分析纯化的hsGITRL和ILZ-hsGITRL蛋白与抗hGITRL mAb的结合特异性。（3）利用Ficoll液密度梯度分离人外周血单个核细胞,通过免疫磁珠法分离CD4+T细胞,流式细胞术检测人CD4+T细胞的纯度。分别将纯化的hsGITRL和ILZ-hsGITRL蛋白按照一定的浓度加入人CD4+T细胞的培养体系,在抗人CD3 mAb存在情况下,培养72小时,通过CCK-8法检测T细胞增殖情况。在相同的培养条件下,收集细胞培养上清,通过ELISA试剂盒检测IFN-γ的水平。分别将纯化的hsGITRL和ILZ-hsGITRL蛋白按照一定的浓度加入上述人CD4+T细胞的培养体系,在指定的不同的时间点收集培养细胞,通过Western blot方法检测ERK1/2的磷酸化水平。（4）通过凝胶过滤层析Sephadex G-100柱和非还原性SDS-PAGE分析hsGITRL和ILZ-hsGITRL蛋白的结构特征,初步揭示其蛋白质性质。结果:（1）成功构建原核表达载体PET32a（+）-hsGITRLaa52-177和PET32a（+）-ILZ-hsGITRLaa52-177,经PCR和双酶切鉴定分别可见446bp和557bp的目的条带,测序结果显示hsGITRLaa52-177基因与GenBank中发表的序列（BC112032）完全一致。ILZ序列与化学合成的ILZ序列一致。（2）将鉴定正确的表达载体导入ROS工程表达菌,以终浓度0.6mmol/L IPTG、25℃、诱导8h作为最佳蛋白诱导条件。利用超声裂解法裂解菌体,发现诱导表达的Trax-hsGITRL和Trax-ILZ-hsGITRL融合蛋白主要存在于胞质中。通过SDS-PAGE和Western blot证实Trax-hsGITRL蛋白的相对分子量约为28KD,Trax-ILZ-hsGITRL蛋白的相对分子量约为32KD。经过Ni+-IMAC柱纯化的Trax-hsGITRL,以及Trax-ILZ-hsGITRL融合蛋白的纯度均＞90%。Trax-hsGITRL和Trax-ILZ-hsGITRL融合蛋白经过肠激酶酶切后,再次经过Ni+-IMAC柱纯化,收集到纯化的hsGITRL和ILZ-hsGITRL蛋白。SDS-PAGE和Western blot证实hsGITRL蛋白的相对分子量约为14KD,ILZ-hsGITRL蛋白的相对分子量约为18KD。通过ELISA法证实纯化的hsGITRL和ILZ-hsGITRL蛋白能够与抗hGITRL mAb特异结合。（3）免疫磁珠法分离获得人CD4+T细胞,纯度在＞92%左右。细胞增殖试验显示在亚浓度的抗CD3 mAb存在下,hsGITRL和ILZ-hsGITRL蛋白在0.5～5μg/ml之间均能够有效地促进CD4+T细胞的增殖,并存在蛋白浓度依赖关系,而且ILZ-hsGITRL比hsGITRL蛋白的刺激作用更为显著。,通过ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ的含量,发现ILZ-hsGITRL比hsGITRL蛋白更有效地促进IFN-γ的分泌。通过细胞信号通路分析,证实hsGITRL和ILZ-hsGITRL蛋白均能有效地增强ERK1/2磷酸化水平,而且ILZ-hsGITRL促进ERK1/2磷酸化的能力更加明显。（4）凝胶过滤层析和非还原性SDS-PAGE分析显示hsGITRL在溶液中主要以二聚体形式存在,单体和三聚体含量相对较少,而ILZ-hsGITRL蛋白在溶液中主要以三聚体含量存在,单体和二聚体含量相对较少。结论:（1）成功构建原核表达载体PET32a（+）-hsGITRLaa52-177和PET32a（+）-ILZ-hsGITRLaa52-177,并在ROS表达工程菌中表达目的蛋白。通过Ni+-IMAC柱两次纯化和肠激酶酶切,获得可溶性的hsGITRL和ILZ-hsGITRL目的蛋白。（2） hsGITRL和ILZ-hsGITRL蛋白均能够与抗hGITRL mAb特异性结合。与hsGITRL蛋白相比,ILZ-hsGITRL蛋白明显促进ERK1/2磷酸化,从而增强人CD4+T细胞的增殖能力和IFN-γ的分泌。（3）hsGITRL和ILZ-hsGITRL蛋白的生物学功能的差异可能与其各自的生物学结构有一定的关系。在溶液中,以三聚体为主要存在形式的ILZ-hsGITRL蛋白比以二聚体为主要存在形式的hsGITRL蛋白能够更好的发挥生物学功能。