结肠直肠癌(CRC)是目前亚洲第三大恶性肿瘤,因其高发病率和死亡率成为世界范围内的主要健康问题。揭示结肠癌的癌变机制显得尤为重要。肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)是一种衔接蛋白,在多种癌症中高度表达,并在肿瘤的发生发展、侵袭以及转移方面起着重要的作用,但其在人结肠癌中的作用鲜见报道。目的运用基于SILAC技术的定量蛋白质组学考察TRAF6对人结肠癌细胞全蛋白表达谱和棕榈酰化修饰蛋白表达谱的影响,并从蛋白整体水平及蛋白翻译后修饰水平探索TRAF6调控人结肠癌细胞发生发展的分子机制。方法1、运用q PCR和Western blot技术分别在m RNA和蛋白水平上对已构建的稳定敲减TRAF6的HCT116细胞株中TRAF6的敲减效率进行验证。2、运用基于SILAC技术的定量蛋白质组学考察TRAF6对人结肠癌细胞全蛋白表达谱的影响。3、运用生物信息学软件分析人结肠癌细胞中TRAF6介导调控的差异蛋白所参与的生物过程、分子定位、生物功能和信号通路。4、运用分子生物学技术对主要参与的信号通路进行生物验证。5、以野生型人结肠癌细胞HCT116细胞为研究对象构建基于SILAC和点击化学的棕榈酰化修饰蛋白组的定量分析方法。6、采用构建成功的基于SILAC和点击化学的棕榈酰化修饰蛋白组的定量分析方法对TRAF6调控人结肠癌细胞的棕榈酰化修饰蛋白质组进行定性和定量分析并鉴定其棕榈酰化位点。7、运用生物信息学软件对人结肠癌细胞中TRAF6介导调控的差异表达的棕榈酰化蛋白进行GO注释分析。结果1.基于SILAC的定量蛋白质组学分析TRAF6对人结肠癌细胞全蛋白表达谱的影响,发现TRAF6在人结肠癌细胞中参与调控了胆固醇的生物合成通路。2.在人结肠癌细胞中TRAF6的敲减促进了胆固醇生物合成通路中关键蛋白HMGCS1和FDFT1的表达,不仅升高了人结肠癌细胞内总胆固醇水平,还诱使更多的胆固醇转移至质膜,使得质膜中的胆固醇水平亦明显升高。3.在人结肠癌细胞中TRAF6下调介导胆固醇水平的提高与LDLR介导的外源性胆固醇的摄取,SREBP2介导的胆固醇合成通路中关键蛋白的转录调控,ACSS2介导的乙酰Co A的合成和ABCA1介导的胆固醇外排的调控机制无明确相关性。4.运用NEM修饰替换疏水性棕榈酰化修饰链,结合基于SILAC和点击化学的定量蛋白质组学分析方法,成功实现对棕榈酰化修饰蛋白的定性定量分析和对棕榈酰化蛋白修饰位点的鉴定。5.运用上述建立的棕榈酰化修饰蛋白的分析方法,研究了TRAF6对人结肠癌细胞中棕榈酰化修饰蛋白表达谱的影响。从中筛选出27个蛋白的棕榈酰化修饰程度发生变化。这些蛋白多定位于细胞膜,主要参与细胞-细胞之间的粘附、m RNA稳定性的调控、m RNA分解代谢过程的正调控、NIK/NF-?B信号通路、葡萄糖代谢过程等生物过程。这些生物过程多伴随于结肠癌发生发展、侵袭和迁移的过程中。结论1.TRAF6抑制胆固醇的生物合成通路,通过降低细胞内胆固醇水平,重塑脂筏结构,进而影响与结肠癌发生发展的蛋白在脂筏中的定位及下游信号传导,最终影响人结肠癌细胞的生长、增殖、侵袭和迁移。2.TRAF6通过介导信号蛋白的棕榈酰化修饰过程参与到与结肠癌发生发展相关联的生物过程中,如细胞与细胞间粘附、葡萄糖代谢等生物过程。