目的:　　 建立牛胚胎干细胞的获取、分离、培养体系，摸索牛ESCs的培养条件。为核移植的优选供体细胞，用于提高牛的克隆和牛乳腺生物反应器研究的效率。　　 方法:　　 本试验分为两部分:一，饲养层的制备。饲养层包括牛骨髓充质干细胞饲养层、牛乳腺干细胞饲养层和牛成纤维细胞饲养层。牛MSCs饲养层的制备采用:从屠宰场得到新鲜牛股骨，用注射器抽取骨髓间充质干细胞，过滤离心，培养传代，取第3代生长旺盛的牛MSCs，采用丝裂霉素C处理，然后用磷酸缓冲液清洗后用做饲养层。牛MaSCs饲养层的制备采用:从屠宰场得到新鲜荷斯坦奶牛乳腺，酒精消毒，PBS清洗，剪成小块，消化离心，接种培养，传代，取第3代牛MaSCs用做饲养层。牛SFCs饲养层的制备采用:组织块培养法培养黑牛上皮组织和肉牛肌肉组织，采用第3代的牛SFCs做饲养层。二，牛胚胎干细胞的获得分离培养及鉴定。牛胚胎干细胞的获得采用:选取健壮、发情周期正常、2-3胎母牛做实验牛，待发情后用FSH减量注射法激素处理母牛，人工授精，冲胚得到胚胎，将胚胎移至制备好的饲养层培养皿中孵化培养，囊胚ICM细胞数量增殖4-6d后，得到生长集中、隆起明显的ICM集落，即牛胚胎干细胞。牛胚胎干细胞分离培养及鉴定:在体视镜下，用自制的口吸管连接玻璃微针小心挑起ICM，使之与饲养层以及滋养层细胞分离，对牛胚胎干细胞进行传代培养，并进行形态学、染色、核型分析等鉴定。　　 在试验中选用了三种不同的细胞（牛骨髓间充质干细胞、牛成纤维细胞、牛乳腺干细胞）作饲养层来进行分离培养牛ES细胞，比较了其培养效果。选取三种胰酶+EDTA组合（0.25％胰酶-0.04％EDTA、0.20％胰酶-0.04％EDTA和0.02％胰酶-0.04％EDTA）消化处理牛ES细胞，比较其消化效果。对胚胎进行冷冻解冻三种不同处理（鲜胚、冻存解冻1次、冻存解冻2次），观察牛ESCs生长状况。　　 结果:　　 1.证明牛ESCs和饲养层有着很大的关系，用牛MSCs做饲养层培养的牛ESCs要比用牛MaSCs和FSCs做饲养层试验研究效果好;　　 2.用较低浓度的消化液（0.02％胰酶-0.04％EDTA）消化得到的ESCs克隆率最高，所传代数最高，效果较好;　　 3.冷冻与解冻处理不会对牛ESCs产生损害性的影响，牛ESCs具有一定的抗外界环境的能力。　　 4.相近的集落，通过相互吸引，具有自发形成典型的ES集落的能力。　　 5.通过形态学观察，核型分析，及AKP染色鉴定符合牛ESCs特征。