【摘 要】
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农药在农产品生长保护、储运等过程中广泛使用。维持农业高速发展的同时,也带来了健康风险。许多国家的监管机构都建立了农药残留的监测,但面对体量大、种类繁多的农产品,有必要建立快速、灵敏的检测方法来适应实际检测需求。本课题以2,4-滴、仲丁灵、氟乐灵、氟苯虫酰胺和水胺硫磷这五种农药为对象,制备了单克隆抗体,并建立了间接竞争酶联免疫吸附法（ic-ELISA）和胶体金免疫层析法（GICA）这两种免疫快速检测
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农药在农产品生长保护、储运等过程中广泛使用。维持农业高速发展的同时,也带来了健康风险。许多国家的监管机构都建立了农药残留的监测,但面对体量大、种类繁多的农产品,有必要建立快速、灵敏的检测方法来适应实际检测需求。本课题以2,4-滴、仲丁灵、氟乐灵、氟苯虫酰胺和水胺硫磷这五种农药为对象,制备了单克隆抗体,并建立了间接竞争酶联免疫吸附法（ic-ELISA）和胶体金免疫层析法（GICA）这两种免疫快速检测方法。从目标物的化学结构出发,综合考虑原料获取、衍生难度等因素,设计改造并合成半抗原。碳二亚胺法合成完全抗原,经鉴定后对小鼠进行免疫。采用ic-ELISA检测抗血清,选择合格阳性脾细胞供体进行细胞融合。经选择性培养、ic-ELISA筛选,有限稀释法亚克隆,最终获得单克隆细胞株。将其扩大培养以制备腹水,经辛酸-饱和硫酸铵法纯化得到2,4-滴抗体3C9、仲丁灵抗体5G6、氟乐灵抗体4H6、氟苯虫酰胺抗体2B1和水胺硫磷抗体3G11,亚型分别为Ig G1、Ig G1、Ig G2b、Ig G2a和Ig G2b,亲和力常数分别为6.773×10~9 L/mol、6.876×10~9 L/mol、3.871×10~9 L/mol、5.279×10~9 L/mol、4.068×10~9 L/mol,交叉反应率均小于5%,具有高特异性。通过确定工作点（抗原与抗体的反应浓度）和优化缓冲液体系（p H、离子强度、甲醇含量）,分别建立了相应的ic-ELISA检测方法。2,4-滴、仲丁灵、氟乐灵、氟苯虫酰胺、水胺硫磷的检测线性范围(IC20～IC80)分别是0.64～9.80 ng/m L、0.77～15.11 ng/m L、0.41～8.79 ng/m L、0.46～5.22 ng/m L、0.86～23.50 ng/m L;半数抑制率(IC50)分别为2.50ng/m L、3.42 ng/m L、1.89 ng/m L、1.55 ng/m L、4.48 ng/m L。结合GB 2763-2021食品安全国家标准中的限量要求和实际使用情况,选择白菜、青椒等蔬菜样本进行添加回收实验,结果表明样品的回收率为80%～120%,变异系数均小于10%。通过优化胶体金标记抗体条件与划线浓度,建立了GICA方法,用于蔬菜样本中相应农药残留的定性及定量分析。定性结果显示:2,4-滴试纸条在白菜和豆芽中的消线值均为200 ng/g,仲丁灵试纸条在白菜和青椒中的消线值均为200 ng/g,氟乐灵试纸条在白菜和青椒中的消线值均为100 ng/g,氟苯虫酰胺试纸条在白菜和黄瓜中的消线值均为100 ng/g,水胺硫磷试纸条在白菜和萝卜中的消线值均为100 ng/g。根据建立的GICA标准定量曲线,2,4-滴在白菜和豆芽基质中检测限分别为1.2 ng/g和3.2 ng/g,仲丁灵在白菜和青椒中检测限分别为2.21 ng/g和0.64 ng/g,氟乐灵在白菜和青椒中检测限分别为3.83 ng/g和2.92 ng/g,氟苯虫酰胺在白菜和黄瓜中检测限分别为3.87 ng/g和1.17 ng/g,水胺硫磷在白菜和萝卜中样本中检测限分别为1.76 ng/g和1.23 ng/g。另外,蔬菜样本五种农药的添加回收率均为80%～120%,变异系数均小于15%,检测结果与LC-MS/MS一致,说明GICA是一种灵敏、高效、可靠的快速检测方法,可应用于大量蔬菜农产品的农残快速筛查。
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