论文部分内容阅读
西瓜（Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum.et Nakai）是重要的大众化水果,原产于非洲,为葫芦科西瓜属1年生草本蔓生植物。西瓜的遗传基础十分狭窄,常规育种技术对某些性状的改良较为困难。基因工程技术为定向改良西瓜新品种提供了一条新的途径。高效离体再生体系的建立是利用基因工程技术进行西瓜种质资源改良的基础。目前对西瓜遗传转化体系尚缺乏深入系统的理论研究,迄今为止由于研究者采用的品种、取材方法、培养条件不同及个人经验的差异导致文献报道的结论差异较大,甚至完全相反,缺乏可重复操作性。鉴于这种情况的存在,很有必要对于西瓜组织再生体系进行深入系统的基础性研究工作。西瓜95%由水构成,每年仅北京地区就需数千万以至亿立方米的水。由于北京地上水很少,又多存于山区,地上无水可供,地下水量的不足与需水量不断增加的矛盾日益尖锐和突出。鉴于此,对西瓜转化抗旱基因使之节水势在必行。甜菜碱是植物重要的渗透调节物质,可以增强植物的抗逆性。由于甜菜碱合成途径很简单,进行遗传操作是方便的,所以甜菜碱合成酶基因被认为是最重要和最有希望的胁迫抗性基因之一。本试验试图通过筛选高效再生基因型,优化西瓜再生体系,在此基础上优化西瓜遗传转化体系,并将BADH基因导入西瓜,以获得抗旱新品种。试验结果如下:1.筛选出5种高效再生基因型并优化了以西瓜子叶为外植体的离体再生体系通过对23种基因型的比较分析,从中筛选出鲁圆、三白、FW351、PM2和京母5种高效再生基因型,他们在最适培养基下获得的最高不定芽诱导率分别为90.0%,85.0%,82.5%,82.5%和80.0%:芽诱导率低于10%的基因型有两种,分别是白-HC（7.5%）和中信（0%）,几乎不能诱导出芽。说明不同基因型其不定芽诱导率不同,有明显的基因型差异。最终优化的西瓜离体再生体系为:切取嫩绿色时的西瓜子叶,置于MS+3.0mg/LBA的培养基上诱导生芽,切芽丛转到MS+0.2mg/LKT培养基上,待芽伸长到2cm左右时转到生根培养基MS+0.5mg/LIAA上,根系粗壮后,先在1/2MS浸泡过的无菌营养土中养苗,待长出新根后再移栽到营养钵中。2.建立了农杆菌介导的遗传转化体系通过对影响西瓜转化效率的预培养培养基及培养时间、共培养培养基及培养时间、侵染时间及侵染液浓度等各项因素进行比较试验,确定了最终的转化条件:切取转化受体材料在培养基MS+3.0mg/LBA中预培养1～2d。将二次活化至OD600=0.4的菌液离心,重悬于相同体积添加200μmol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中,将预培养叶片放入其中,侵染10min,灭菌滤纸吸干,放入添加200μmol/L乙酰丁香酮的培养基MS+3.0mg/LBA中,暗培养3～4d。共培养结束后,将叶片在附加300mg/LCef的1/2MS液体培养基中轻轻振荡洗涤30min,灭菌滤纸吸干,转入MS+3.0mg/LBA+100mg/LKm+300mg/LCb中进行筛选分化培养,出芽后转入MS+0.2mg/LKT+75mg/LKm+100mg/LCb)中进行增殖筛选。再生芽转入生根筛选培养基1/2MS+0.5mg/LIAA+30mg/LKm+50mg/Lcef中进行生根筛选。3.甜菜碱醛脱氢酶基因的导入及转基因植株的鉴定在优化的西瓜子叶转化体系上,将甜菜碱醛脱氢酶基因导入西瓜,阳性抗性芽诱导率为0.8%,共获得15株伸长的抗性芽。PCR检测显示,其中4株显示PCR阳性。