家蚕铁蛋白基因的克隆、表达及其生物学分析

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铁元素是生命体中必不可少的微量元素,在生物的生长发育过程中发挥着重要作用。铁蛋白,一种分布广泛的球形蛋白,能够以稳定的形式大量储存铁。铁蛋白通过储存和释放铁来维持机体内铁平衡。铁蛋白不仅是机体中重要的铁储存蛋白,也能有效保护生物体免受来自氧自由基的损伤。与此同时,铁蛋白含量可以作为一些疾病预防检测的明确指标。对铁的代谢吸收及铁对基因调控的研究,进一步说明了维持铁平衡对生物体有重要意义。同时,相对于只能携带两个铁原子的转铁蛋白,铁蛋白结合铁的能力更强具有更高的效率。昆虫的铁蛋白属于分泌型铁蛋白,更有可能具有运输铁的能力。人体铁蛋白受体的发现表明铁蛋白运送铁这一功能是保守的,所以昆虫铁蛋白功能研究有助于发现人体铁蛋白功能研究方向。目前,人们已经鉴定了多种生物的铁蛋白基因,但是还没有对家蚕铁蛋白基因的相关报道。作为一种重要的模式生物,家蚕世代形态分明,方便进行各组织取材,与果蝇相比个体大小适中,便于观察与采集。   本文通过在GenBank数据库中查询得到家蚕的铁蛋白基因,利用生物信息学方法进行初步的分析和比较,查找到家蚕铁蛋白两个亚基FerHCH与FerLCH的基因序列。依据查询的序列设计引物进行PCR扩增,构建重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。分别得到了分子量约为21kDa与24kDa的重组蛋白。经过质谱鉴定,与查找到的肽段相一致。纯化重组蛋白并制备识别家蚕铁蛋白H、L和HL的多克隆抗体。应用蛋白免疫印迹(Western Blot)技术初步检测铁蛋白在家蚕不同组织不同龄期中的表达。结果发现对于五龄的家蚕,脂肪体、精巢、卵巢中铁蛋白的表达量要明显高于其他组织;而对于不同龄期的家蚕,卵、蛹、蛾的铁蛋白量明显高于其他龄期。在大肠杆菌中表达的重组家蚕铁蛋白是以不可溶的包涵体形式存在。用变性剂8M尿素溶解包涵体蛋白,除去高浓度尿素引导蛋白重新折叠,获得可溶性家蚕铁蛋白。应用聚丙烯酰胺凝胶电泳与铁染色检测重折叠的家蚕铁蛋白表明其具有特定四级结构并且能储存铁。对该重组蚕铁蛋氧化亚铁能力的定量测定进一步表明重组蛋白具有活性。而且家蚕铁蛋白氧化亚铁活性耐受高温和极性pH的处理,这与其它物种的铁蛋白高度稳定这一特性一致。
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