背景:中国国家癌症中心发布的《2019年中国最新癌症报告》中指出肺癌位居我国恶性肿瘤发病首位,结果显示:2015年我国新发肺癌病例约为78.7万例,发病率为57.26/10万,中标率为35.96/10万,其中男性发病率和死亡率均高于女性,城市发病率和死亡率高于农村,且年龄别死亡率变化趋势和发病相似,随年龄增加逐渐上升。肺癌已成为对我国国民健康威胁最大的恶性肿瘤之一。加深对肺癌发病和进展机制的认识,有助于加快攻克肺癌的预防、早期发现和相关治疗的脚步。已知的肺癌类型包括非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)两大类。NSCLC约占所有肺癌的85%,与SCLC相比其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。而SCLC具有恶性程度高、倍增时间短、转移早等特点,虽对化疗、放疗敏感,但易复发,且多数确诊时已经广泛转移,故SCLC往往很难治愈,其死亡率居高不下。SCLC与NSCLC在病理、临床特点、治疗方案等方面存在显著差异。大量的研究表明异常的免疫应答与肺癌的发生发展密切相关,深入了解SCLC和NSCLC的免疫应答的差异,将有助于肺癌的个体化诊疗。肿瘤浸润的巨噬细胞在肺肿瘤的发生和发展中起着关键的作用。巨噬细胞传统定义为经典活化型(M1型)和替代活化型(M2型)巨噬细胞。M1型巨噬细胞主要分泌白介素(interleukin,IL)-12等促炎因子来清除细菌和肿瘤细胞。M2型巨噬细胞,主要分泌IL-10,参与组织修复、促进肿瘤生长和转移。Ang Yuan等在2015年揭示了M1型和M2型巨噬细胞对肺癌细胞具有相反的作用,提示M1/M2极化可能作为肺癌免疫治疗的潜在靶点。Almatroodi S A等人的研究表明,巨噬细胞的异常极化与NSCLC患者的预后相关。随后,Iriki团队研究发现肿瘤相关巨噬细胞通过激活STAT3与SCLC细胞相互作用从而促进肿瘤进展。肺组织中的巨噬细胞多数来源于外周循环血液中的单核细胞,然而巨噬细胞和单核细胞在SCLC和NSCLC中的分布差异及其潜在的临床意义尚不清楚。T细胞为主的适应性免疫在肺癌免疫中也发挥重要的作用。传统标记为CD4+CD25+Foxp3+的Treg是一类控制体内自身免疫反应的T细胞亚群,在维持免疫稳态和预防自身免疫中发挥重要作用。既往研究表明,NSCLC患者的疾病进展与外周循环血液中明显增多的CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞相关。此外,近年来基于T细胞检查点抑制剂的免疫治疗在肿瘤治疗中显示出良好的前景。大量研究表明程序性死亡受体(Programmed cell death protein,PD)-1细胞在癌症免疫逃避中起着重要作用。2015年美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准了NSCLC相关的抗PD-1免疫治疗药物的临床应用。滤泡辅助性T细胞(Follicular helper T cells,Tfh)形成于生发中心,在体液免疫中发挥重要作用。外周循环血液辅助性T细胞(Peripheral helper T cells,Tph)与Tfh细胞功能类似,同样表达PD-1表面分子,能够辅助诱导浆细胞分化,在体液免疫中发挥重要作用。研究表明Tph细胞与多种自身免疫性疾病的发生发展密切相关。然而,Treg细胞、PD-1~+Tfh细胞以及Tph细胞在肺癌中的变化及潜在的临床意义尚不清楚。目的:研究SCLC和NSCLC患者的支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和外周循环血液中的巨噬细胞/单核细胞、Treg细胞、PD-1~+Tfh细胞及Tph细胞的频数变化、相关细胞因子的水平,探究上述细胞亚群的变化与疾病的进展或预后的潜在相关性。以期为肺癌的个体化诊疗提供新的思路。方法:所有SCLC和NSCLC患者的诊断是依据2015年中国抗癌协会肿瘤临床化疗专业委员会发布的《中国原发性肺癌诊疗规范》中的诊断标准。并按照2012年国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)临床实践指南中提出的TNM分期系统进行分期。1.纳入32例SCLC和35例NSCLC患者以及年龄和性别相匹配的14例支气管扩张患者作为对照组(control subjects,CS)。同时采集受试者的肺泡灌洗液及外周血。通过单个核细胞提取技术和流式细胞技术检测受试者外周血、肺泡灌洗液中的单核细胞/巨噬细胞标记物CD14/CD206/IL-10/IL-12的表达水平。采用微量样本多指标流式蛋白定量技术(Cytometric bead array,CBA)检测血清和灌洗液上清中的细胞因子IL-10的含量,并分析上述细胞和因子在实验组内与对照组之间的差异及其与临床指标之间的关系。2.与方法1为同一批受试者。通过单个核细胞提取技术和流式细胞技术检测受试者外周血、肺泡灌洗液中的Treg细胞标记物CD3/CD4/CXCR5/CD25/Foxp3的表达水平。并分析上述细胞在实验组与对照组之间的差异及其与临床指标之间的关系。3.由于应用流式细胞术检测外周血单个核细胞中各细胞亚群的频数和表型时,所需要外周血的数量较多,不符合伦理要求。因此,我们第三部分实验纳入的患者及对照组与前两部分实验不同。纳入26例SCLC和26例NSCLC患者以及年龄和性别相匹配的20例肺炎患者及20例健康志愿者作为对照组。同时采集受试者的肺泡灌洗液及外周血。通过单个核细胞提取技术和流式细胞技术检测患者外周血、肺泡灌洗液中的PD-1~+T细胞亚群标记物PD-1/CXCR5/CD4/CD8的表达水平。并进一步分析上述细胞亚群频数在实验组内与对照组之间的变化差异及其与临床指标之间的关系。结果:1.结果显示,与NSCLC患者相比,SCLC患者的BALF中CD14~+、CD206~+CD14~+、IL-10~+CD206~+CD14~+M2样巨噬细胞的频数明显升高并伴随IL-10水平升高,而在两组患者外周血中并没有观察到CD14~+、CD206~+CD14~+、IL-10~+CD206~+CD14~+M2样单核细胞的频数差异;SCLC患者BALF中升高的IL-10~+CD206~+CD14~+M2样巨噬细胞频数及IL-10浓度与肿瘤进展呈正相关,与生存时间呈负相关;SCLC患者BALF上清中IL-10水平与IL-10~+CD206~+CD14~+M2样巨噬细胞频数呈正相关;化疗后SCLC患者循环IL-10~+CD206~+CD14~+M2样单核细胞水平明显升高。2.无论是BALF还是外周血样本,SCLC和NSCLC患者中的Foxp3~+CD25~+CXCR5~-CD4~+Treg细胞频数都显著高于对照组,且SCLC组显著高于NSCLC组,并与肿瘤进展显著正相关;SCLC患者BALF中IL-10~+CD206~+CD14~+M2样巨噬细胞频数与Foxp3~+CD25~+CXCR5~-CD4~+Treg细胞频数呈正相关。3.SCLC患者外周血循环PD-1~+Tfh细胞频数明显高于NSCLC、肺炎及健康对照组,且与SCLC肿瘤进展相关;SCLC患者外周血循环Tph细胞频数明显高于NSCLC、肺炎及健康对照组;SCLC患者的BALF中Tph细胞的频数明显低于NSCLC和肺炎组;未观察到Tph细胞与肺肿瘤进展的相关性;SCLC患者循环PD-1~+CXCR5~+Tfh/PD-1~+CXCR5~-Tph细胞比率显著低于健康对照组,且与肿瘤进展相关;此外,SCLC患者循环PD-1~+Tfh细胞和Tph细胞频数在化疗后显著下降。结论:1.SCLC患者BALF中IL-10~+CD206~+CD14~+M2样巨噬细胞频数增多,且IL-10~+CD206~+CD14~+M2样巨噬细胞与肿瘤的进展和预后密切相关,提示IL-10~+CD206~+CD14~+M2样巨噬细胞频数的变化可作为SCLC进展和预后的评估指标及治疗的潜在靶点。2.SCLC患者Foxp3~+CD25~+CXCR5~-CD4~+Treg细胞频数增多,且与肿瘤的进展显著相关。SCLC患者BALF中IL-10~+CD206~+CD14~+M2样巨噬细胞的增多与活化的Treg细胞相关。研究证明了Treg细胞在SCLC发病机制中的重要作用。3.SCLC外周血循环PD-1~+Tfh细胞频数显著增高,并与肿瘤进展相关。依托泊苷和顺铂联合化疗对SCLC患者外周血PD-1~+CXCR5~+Tfh和PD-1~+CXCR5~-Tph细胞有影响。表明循环PD-1~+Tfh细胞可能参与了SCLC肿瘤的发生和发展。