论文部分内容阅读
从防己科千金藤属山乌龟亚属（Subgen.Tuberiphania Lo et M.Yang）植物中分离获得的异喹啉类生物碱（Isoquninoline alkaloids）青风藤碱（sinoacutine,sino）,前期研究表明青风藤碱在小鼠耳廓肿胀、小鼠肉芽肿、大鼠胸膜炎和小鼠碳粒廓清等多种炎症与免疫抑制模型中均表现出较强的抗炎与免疫抑制活性,但尚待进行细胞分子水平研究,以确认其抗炎作用并探索作用机制,也待在炎性相关病症中进行抗炎活性研究。本文采用LPS刺激小鼠巨噬细胞建立体外炎症反应模型,从炎症因子PGE2、COX-2、iNOS的表达及炎症主要通路NF-κB、MAPKs的活化来探讨青风藤碱在巨噬细胞中发挥的抗炎作用及其可能的分子机制。并通过建立LPS诱导小鼠急性肺损伤模型,检测青风藤碱对模型小鼠肺组织和肺泡灌洗液中细胞因子释放的影响,以期为青风藤碱后续更深入的研究开发及其在炎性疾病中的应用提供实验依据。研究内容具体如下:1.青风藤碱对LPS诱导RAW264.7细胞产生PGE2的影响半数抑制率IC50的测定:采用CCK-8试剂法考察青风藤碱对RAW264.7细胞的半数抑制率,经统计得到青风藤碱IC50=144.487μg/ml。采用1μg/mlLPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症,以青藤碱（100μg/ml）和地塞米松（50μg/ml）作为阳性对照,青风藤碱以100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml剂量预处理2h后与LPS共作用6h,提取细胞培养上清液,用ELISA方法检测炎症因子PGE2,观察青风藤碱对PGE2的影响。结果显示:青风藤碱高（100μg/ml）、低剂量（25μg/ml）能极显著抑制PGE2的生成（P<0.01）,中剂量（50μg/ml）能显著抑制PGE2的生成（P<0.05）。提示青风藤碱是通过调节巨噬细胞产生PGE2而发挥抗炎作用。2.青风藤碱对LPS诱导RAW264.7细胞活化后COX-2和iNOS表达的影响采用1μg/mlLPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症,以青藤碱（100μg/ml）和地塞米松（50μg/ml）作为阳性对照,青风藤碱以100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml剂量预处理2h后与LPS共作用6h,分别提取细胞总RNA并逆转录成cDNA、提取细胞总蛋白,用实时荧光定量PCR和Western免疫印迹实验分别检测青风藤碱COX-2、iNOS基因和蛋白表达的影响。结果显示:青风藤碱高（100μg/ml）、中剂量组（50μg/ml）能显著促进COX-2 mRNA的表达（P<0.05）;青风藤碱三个剂量组能极显著降低COX-2蛋白表达水平（P<0.01）,且具有良好的线性关系。青风藤碱低剂量组对iNOS mRNA有显著抑制作用（P<0.05）;青风藤碱三个剂量组亦能极显著降低iNOS蛋白表达水平（P<0.01）,具有良好的线性关系。提示青风藤碱可能是通过抑制iNOS和COX-2蛋白表达而发挥抗炎作用。根据中心法则,DNA、mRNA、蛋白质三者间趋势应保持一致,而研究发现基因与蛋白之间常出现非线性关系,便说明基因与蛋白结果会出现差异性,但因为蛋白质是最终的表现形式,因此以蛋白结果为主。3.青风藤碱对LPS激活RAW264.7细胞NF-κB信号转导通路的影响采用1μg/mlLPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症,以青藤碱（100μg/ml）和地塞米松（50μg/ml）作为阳性对照,青风藤碱以100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml剂量预处理2h后与LPS共作用24h,提取细胞总蛋白,用Western免疫印迹实验分别检测青风藤碱对NF-κB信号转导通路中p65和IκB-α蛋白的影响,探讨青风藤碱在NF-κB信号通路中的作用机制。结果显示:青风藤碱三个剂量组均能极显著降低p65磷酸化水平（P<0.01）,且具有良好的线性关系。但青风藤碱对IκB-α的磷酸化水平无明显影响。提示青风藤碱可能是通过其他途径而绕过IκB-α蛋白来抑制NF-κB的活化。4.青风藤碱对LPS激活RAW264.7细胞MAPKs信号转导通路的影响采用1μg/mlLPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症,以青藤碱（100μg/ml）和地塞米松（50μg/ml）作为阳性对照,青风藤碱以100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml剂量预处理2h后与LPS共作用24h,提取细胞总蛋白,用Western免疫印迹实验分别检测青风藤碱对MAPKs信号转导通路中ERK1/2,JNK和p38信号通路的影响,探讨青风藤碱在MAPKs信号通路中的作用机制。结果显示:青风藤碱高剂量组（100μg/ml）对ERK1/2磷酸化水平有降低趋势但无统计意义,中（50μg/ml）、低剂量组（25μg/ml）能显著促进ERK1/2磷酸化水平（P<0.05）。青风藤碱三个剂量组均能极显著降低JNK磷酸化水平（P<0.01）,同时具有良好的线性关系。青风藤碱高剂量组（100μg/ml）能显著抑制p38磷酸化水平（P<0.05）,而低剂量组（25μg/ml）能显著促进p38磷酸化水平（P<0.05）。提示青风藤碱可能对LPS诱导RAW264.7细胞存在免疫作用,具体作用机制尚不明确。5.青风藤碱对LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型的影响采用10mg/kg LPS建立小鼠急性肺损伤模型,12h后小鼠尾静脉注射给予青藤碱（13mg/kg）、地塞米松（7mg/kg）、青风藤碱高剂量（12mg/kg）、中剂量（6mg/kg）、低剂量（3mg/kg）、克班宁（5mg/kg）,12h后处死,取肺进行肺系数计算、组织匀浆,ELISA法检测匀浆中细胞因子水平及MPO活性,另外进行肺部灌洗并用ELISA法检测细胞因子水平。结果显示:青风藤碱高、低剂量组能极显著减少肺系数,降低肺水肿程度（P<0.01）。青风藤碱高（12mg/kg）、低剂量组（3mg/kg）能显著降低组织匀浆中NO的含量（P<0.05）,中剂量组（6mg/kg）有降低趋势但无显著抑制作用。青风藤碱三个剂量组均能显著抑制匀浆中MPO活力（P<0.05）,抑制中性粒细胞的聚集。青风藤碱中（6mg/kg）、低剂量组（3mg/kg）能极显著降低组织匀浆中TNF-α的含量（P<0.01）,高剂量组有降低趋势但无显著性。青风藤碱三个剂量组均能极显著抑制匀浆中IL-6（P<0.01）,且具有良好的线性关系。在肺泡灌洗液细胞因子检测中,青风藤碱中（6mg/kg）、低剂量组（3mg/kg）能显著降低TNF-α的含量（P<0.05）;青风藤碱三个剂量组均能极显著抑制IL-6（P<0.01）。提示青风藤碱是通过抑制NO、MPO、TNF-α和IL-6的产生来发挥治疗小鼠急性肺损伤的作用。通过上述研究发现,在体外实验中,青风藤碱通过抑制iNOS和COX-2发挥抗炎作用,同时青风藤碱抑制NF-κB和JNK信号通路而达到抗炎效果;在体内实验中,青风藤碱抑制LPS诱导的肺部疾病和炎症从而发挥抗炎作用,使NO、MPO、TNF-α和IL-6的表达水平下降。以上结果为青风藤碱的研发提供了一定的实验数据和思路。