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蛋白之间的相互作用在生物的各种功能调节中起重要作用。已有的研究结果表明,LIM同源域蛋白家族转录因子Isl1(insulin gene enhancer binding protein 1)可以调控胰岛素的基因表达和激素分泌,但是否存在其他蛋白与Isl1共同发挥作用尚不清楚。本文主要通过构建酵母双杂交Isl1诱饵质粒和睾丸cDNA文库,筛选Isl1的互作蛋白,并且以小鼠胰岛原代细胞和β细胞系NIT细胞为对象,比较系统地研究了转录因子Isl1和互作蛋白PIASy(protein inhibitor of activated STAT 4)对胰岛素合成与分泌的调节功能和相关机理。取得的主要研究结果包括:1.构建了 Isl1诱饵质粒,并针对Isl1的转录激活域进行了改造。结果显示经过改造的诱饵质粒去除了 Isl1自身的自激活活性,可以用作蛋白筛选。构建了酵母双杂交睾丸cDNA文库。经过检测文库滴度达到5.0×107 cfu/mL。2.通过酵母双杂交,钓出了四个Isl1的互作蛋白。它们分别是蛋白PIASy(protein inhibitor of activated STAT 4)、Aip(aryl-hydrocarbon receptor-interacting protein)、Mypop(myb-related transcription factor,partner of profilin)和 Sap 18(sin3-associated polypeptide 18)。3.通过酵母共转实验以及蛋白质免疫共沉淀技术,验证了 Isl1和PIASy蛋白之间的相互作用。免疫荧光双染结果显示Isl1和PIASy共同定位在胰岛β细胞和NIT细胞。4.在体外培养的胰岛原代细胞和NIT细胞中超表达Isl1和PIASy后,结果显示胰岛素基因的表达水平和激素分泌显著升高;用siRNA抑制Isl1和PIASy后,胰岛素基因的表达水平和激素分泌下降明显。说明PIASy可以通过蛋白互作的方式协同Isl1调节胰岛素基因的表达水平和激素分泌。检测2型糖尿病小鼠模型db/db小鼠中Isl1与PIASy基因表达结果显示,Isl1与PIASy的mRNA表达水平上升,提示二者可能与糖尿病发病相关。5.双荧光素酶报告基因结果显示,当Isl1和PIASy均超表达时,胰岛素基因的转录激活活性明显提高,并且高于Isl1或PIASy单独存在时胰岛素基因的转录激活活性。说明PIASy与Isl1通过共同调节胰岛素基因启动子活性实现对胰岛素的调节。6.Isl1突变体去除homeodomain同源域后,胰岛素基因的转录激活活性明显下降;PIASy突变体去除ring结构域后,胰岛素基因的转录激活活性也明显下降,两者对胰岛素启动子的协同调节作用明显下降。结果说明,Isl1的homeodomain同源域和PIASy的ring结构域对于胰岛素启动子的调节十分关键。综上所述,本文研究筛选出了Isl1的四种互作蛋白,并研究了其中一种蛋白PIASy与Isl1在胰岛中的功能及作用机理。PIASy与Isl1通过蛋白互作的方式调节胰岛素基因启动子的活性,进而影响了胰岛素基因的表达水平与激素分泌。这些结果有助于发现调节胰岛素表达的新蛋白因子,并为研究糖尿病中胰岛素异常表达的分子机制提供新的资料。