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凝血系统与肿瘤具有密切联系。恶性肿瘤患者往往伴随显著的促凝血状态，而促凝血状态的存在能显著增加肿瘤患者病理性血栓形成的风险。岩藻糖基化硫酸软骨素（fCS）是从海参体壁提取的一种酸性多糖，具有显著的抗凝血和抗癌功效。因此fCS具有抑制肿瘤引起的促凝血状态的可能。但fCS多糖具有激活凝血XII因子（FXII）等严重副作用，极大地限制了其应用研究。降解fCS已被证实能降低fCS多糖相关的副作用。然而，关于高纯度岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖对肿瘤引起的促凝血状态影响的研究未有报道。
本研究选取了美国肉参硫酸软骨素（fCS-Ib）和菲律宾刺参硫酸软骨素（fCS-Pg）为研究对象，采用选择性降解方法降解来源于两种海参的fCS多糖并通过分离纯化得到系列高纯度海参硫酸寡糖；通过NMR和MS等技术对寡糖结构进行鉴定分析；采用发色底物法分析系列海参硫酸寡糖的抗凝血机理和激活FXII能力，阐述明确的构效关系；明确海参硫酸寡糖具有较好的抗凝血活性且不具有海参硫酸多糖相关的副作用后，利用细胞实验和动物实验研究海参硫酸寡糖抑制肿瘤引起的促凝血作用，阐明其构效关系并初步探讨作用机理。主要研究内容包括：
（1）Fenton体系制备低分子量美国肉参岩藻糖基化硫酸软骨素
以美国肉参硫酸软骨素为研究对象，采用以H2O2/Cu2+为基础的Fenton体系对其进行降解，首先研究不同降解条件（pH、H2O2浓度、Cu2+浓度和温度）对fCS-Ib降解效率的影响，并优化降解体系。通过单糖组成和NMR分析降解产物的结构特点并初步分析氧化降解机理。结果表明氧化降解效率随双氧水浓度和反应温度增加而增加；在一定范围内，降解效率随铜离子浓度增加而增加，但当铜离子浓度持续增加，降解效率无显著增加；反应体系pH越低，海参硫酸软骨素降解效率越高。降解产物结构分析结果表明，在降解过程中，fCS的基本结构不变且岩藻糖侧链不受影响，自由基能选择性攻击GlcA进而降解fCS。抗凝血实验则表明海参硫酸寡糖降解产物仍具有较好的抗凝血活性且抗凝血机理与海参硫酸多糖不同。此外，海参硫酸多糖降解之后anti-Xa/anti-IIa比率显著增加，表明氧化降解确实能够降低海参硫酸多糖相关的副作用。
（2）岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖结构与其抗凝血活性的构效关系研究
为阐述明确的海参硫酸寡糖结构与其抗凝血活性的构效关系，本章运用第一章建立的Fenton降解体系对菲律宾刺参硫酸软骨素（fCS-Pg)和美国肉参硫酸软骨素（fCS-Ib）进行降解,采用superdex30多次分离、纯化得到系列不同聚合度、不同岩藻糖侧链硫酸化位点的硫酸寡糖；采用NMR和MS技术分析不同系列寡糖的结构；明确海参硫酸寡糖结构之后，通过凝血实验确定不同结构的寡糖抗凝血活性，并采用底物发色法探索硫酸寡糖抗凝血机理。结果表明，硫酸寡糖主要通过作用于内源性凝血途径发挥效果，且fCS的抗凝血效果与分子量和硫酸化位点密切相关；2，4-O-sulfated硫酸化位点fCS-Ib寡糖相对3，4-O-sulfated硫酸化位点fCS-Pg寡糖具有更好的抗凝血效果。在一定范围内，分子量越大，fCS寡糖抗凝血效果越好，且7糖是靶intrinsic tenase发挥抗凝血的最小活性单元。此外，海参硫酸寡糖激活FXII能力显著低于海参硫酸多糖，糖链长度越短，激活能力越弱；9糖对FXII无显著激活能力。
（3）海参硫酸寡糖体外抑制肿瘤引起的促凝血作用及机制研究
肿瘤的生长和转移能通过直接和间接机制激活凝血级联反应生成凝血酶，促进血液高凝状态或血栓的生成。因而阻碍肿瘤的生长、转移和凝血酶的生成能一定程度抑制肿瘤相关血栓生成。本章采用细胞模型研究了系列海参硫酸寡糖对非小细胞肺癌细胞A549增殖和转移的影响，运用基因芯片实验初步分析硫酸寡糖抗肿瘤的机理；利用发色底物法和试管法分析硫酸寡糖抑制凝血酶生成作用。MTT、划痕、平板克隆形成、transwell实验及体外血管生成实验表明：随着寡糖分子量的增加，寡糖对A549细胞毒性和抑制克隆形成能力增加，对A549的转移和侵袭能力抑制也会增强；硫酸寡糖对血管生成的阻碍作用随着糖链长度增加变强，且所有细胞模型实验结果均表明9糖是具有抗A549的最小活性单元。对基因芯片实验数据进行分析发现，海参糖链的长度会影响差异基因的数量、生物学过程和作用通路。进一步GSEA分析结果表明，9糖主要通过作用于细胞增殖和凋亡相关通路发挥抗肿瘤活性，而12糖通过调控脂质代谢和胆固醇代谢发挥抗肿瘤活性，说明海参糖链的长度能影响其作用机理。qRT-PCR实验结果表明海参硫酸寡糖能下调肿瘤细胞中组织因子（TF）基因表达进而抑制外源性凝血途径生成凝血酶；凝血因子生成和凝血时间测定实验结果表明聚合度为9-18的海参硫酸寡糖能显著抑制凝血酶和FXa的生成，延长凝血时间。
（4）海参硫酸寡糖体内抑制肿瘤引起的促凝血作用研究
为验证海参硫酸寡糖对肿瘤引起的促凝血的抑制作用，本章运用A549移植瘤动物模型做进一步研究。小鼠移植瘤实验结果表明海参硫酸寡糖能明显抑制小鼠肿瘤生长，显著增加小鼠脾脏指数，对小鼠体重无明显影响，且9糖是具有抗肿瘤活性的最小单元；IHC和Western Blot结果则表明，海参硫酸寡糖确实能通过抑制肿瘤细胞增殖和阻碍肿瘤血管生成从而发挥抗肿瘤活性；Elisa实验结果表明海参硫酸寡糖降低肿瘤小鼠体内凝血酶和纤维蛋白原含量，说明硫酸寡糖能抑制肿瘤引起的促凝血状态。以上研究结论均表明海参硫酸寡糖能通过抑制肿瘤生长和作用于凝血系统改善肿瘤引起的促凝血状态。
本研究选取了美国肉参硫酸软骨素（fCS-Ib）和菲律宾刺参硫酸软骨素（fCS-Pg）为研究对象，采用选择性降解方法降解来源于两种海参的fCS多糖并通过分离纯化得到系列高纯度海参硫酸寡糖；通过NMR和MS等技术对寡糖结构进行鉴定分析；采用发色底物法分析系列海参硫酸寡糖的抗凝血机理和激活FXII能力，阐述明确的构效关系；明确海参硫酸寡糖具有较好的抗凝血活性且不具有海参硫酸多糖相关的副作用后，利用细胞实验和动物实验研究海参硫酸寡糖抑制肿瘤引起的促凝血作用，阐明其构效关系并初步探讨作用机理。主要研究内容包括：
（1）Fenton体系制备低分子量美国肉参岩藻糖基化硫酸软骨素
以美国肉参硫酸软骨素为研究对象，采用以H2O2/Cu2+为基础的Fenton体系对其进行降解，首先研究不同降解条件（pH、H2O2浓度、Cu2+浓度和温度）对fCS-Ib降解效率的影响，并优化降解体系。通过单糖组成和NMR分析降解产物的结构特点并初步分析氧化降解机理。结果表明氧化降解效率随双氧水浓度和反应温度增加而增加；在一定范围内，降解效率随铜离子浓度增加而增加，但当铜离子浓度持续增加，降解效率无显著增加；反应体系pH越低，海参硫酸软骨素降解效率越高。降解产物结构分析结果表明，在降解过程中，fCS的基本结构不变且岩藻糖侧链不受影响，自由基能选择性攻击GlcA进而降解fCS。抗凝血实验则表明海参硫酸寡糖降解产物仍具有较好的抗凝血活性且抗凝血机理与海参硫酸多糖不同。此外，海参硫酸多糖降解之后anti-Xa/anti-IIa比率显著增加，表明氧化降解确实能够降低海参硫酸多糖相关的副作用。
（2）岩藻糖基化硫酸软骨素寡糖结构与其抗凝血活性的构效关系研究
为阐述明确的海参硫酸寡糖结构与其抗凝血活性的构效关系，本章运用第一章建立的Fenton降解体系对菲律宾刺参硫酸软骨素（fCS-Pg)和美国肉参硫酸软骨素（fCS-Ib）进行降解,采用superdex30多次分离、纯化得到系列不同聚合度、不同岩藻糖侧链硫酸化位点的硫酸寡糖；采用NMR和MS技术分析不同系列寡糖的结构；明确海参硫酸寡糖结构之后，通过凝血实验确定不同结构的寡糖抗凝血活性，并采用底物发色法探索硫酸寡糖抗凝血机理。结果表明，硫酸寡糖主要通过作用于内源性凝血途径发挥效果，且fCS的抗凝血效果与分子量和硫酸化位点密切相关；2，4-O-sulfated硫酸化位点fCS-Ib寡糖相对3，4-O-sulfated硫酸化位点fCS-Pg寡糖具有更好的抗凝血效果。在一定范围内，分子量越大，fCS寡糖抗凝血效果越好，且7糖是靶intrinsic tenase发挥抗凝血的最小活性单元。此外，海参硫酸寡糖激活FXII能力显著低于海参硫酸多糖，糖链长度越短，激活能力越弱；9糖对FXII无显著激活能力。
（3）海参硫酸寡糖体外抑制肿瘤引起的促凝血作用及机制研究
肿瘤的生长和转移能通过直接和间接机制激活凝血级联反应生成凝血酶，促进血液高凝状态或血栓的生成。因而阻碍肿瘤的生长、转移和凝血酶的生成能一定程度抑制肿瘤相关血栓生成。本章采用细胞模型研究了系列海参硫酸寡糖对非小细胞肺癌细胞A549增殖和转移的影响，运用基因芯片实验初步分析硫酸寡糖抗肿瘤的机理；利用发色底物法和试管法分析硫酸寡糖抑制凝血酶生成作用。MTT、划痕、平板克隆形成、transwell实验及体外血管生成实验表明：随着寡糖分子量的增加，寡糖对A549细胞毒性和抑制克隆形成能力增加，对A549的转移和侵袭能力抑制也会增强；硫酸寡糖对血管生成的阻碍作用随着糖链长度增加变强，且所有细胞模型实验结果均表明9糖是具有抗A549的最小活性单元。对基因芯片实验数据进行分析发现，海参糖链的长度会影响差异基因的数量、生物学过程和作用通路。进一步GSEA分析结果表明，9糖主要通过作用于细胞增殖和凋亡相关通路发挥抗肿瘤活性，而12糖通过调控脂质代谢和胆固醇代谢发挥抗肿瘤活性，说明海参糖链的长度能影响其作用机理。qRT-PCR实验结果表明海参硫酸寡糖能下调肿瘤细胞中组织因子（TF）基因表达进而抑制外源性凝血途径生成凝血酶；凝血因子生成和凝血时间测定实验结果表明聚合度为9-18的海参硫酸寡糖能显著抑制凝血酶和FXa的生成，延长凝血时间。
（4）海参硫酸寡糖体内抑制肿瘤引起的促凝血作用研究
为验证海参硫酸寡糖对肿瘤引起的促凝血的抑制作用，本章运用A549移植瘤动物模型做进一步研究。小鼠移植瘤实验结果表明海参硫酸寡糖能明显抑制小鼠肿瘤生长，显著增加小鼠脾脏指数，对小鼠体重无明显影响，且9糖是具有抗肿瘤活性的最小单元；IHC和Western Blot结果则表明，海参硫酸寡糖确实能通过抑制肿瘤细胞增殖和阻碍肿瘤血管生成从而发挥抗肿瘤活性；Elisa实验结果表明海参硫酸寡糖降低肿瘤小鼠体内凝血酶和纤维蛋白原含量，说明硫酸寡糖能抑制肿瘤引起的促凝血状态。以上研究结论均表明海参硫酸寡糖能通过抑制肿瘤生长和作用于凝血系统改善肿瘤引起的促凝血状态。