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分泌型IgA抗体(sIgA)是黏膜表面主要的抗体类型,可与病原特异性结合从而阻止其入侵机体。派伊尔结(PP结)是肠道sIgA的主要的诱导位点,猪流行性腹泻病毒(PEDV)可诱导猪肠道PP结内IgA免疫应答,然而其分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨PEDV感染免疫过程中促进猪肠道PP结内黏膜免疫应答的重要因子及其分子机制。为确定PEDV感染能在猪肠道有效诱导黏膜免疫应答,本研究首先将PEDV弱毒株采用口服并结合后海穴免疫途径接种一月龄仔猪并分析其免疫应答。结果表明,PEDV不仅诱导了血清中病毒特异性IgG和IgA的产生,也促进了肠道内容物中特异性IgA的生成;因此,PEDV感染免疫可成功诱导猪肠道黏膜免疫应答。为准确评价猪B细胞内IgA类别转换的发生,本研究建立了猪IgA~+B细胞抗体类别转换过程中三种关键标志物(GLTα、PSTα及CTα)的PCR检测方法,获得了该三种重组产物的核酸序列,并对其扩增条件进行了优化,最终成功建立了重复性良好的检测上述三种关键分子的方法。该方法的建立为研究猪IgA产生机制奠定了坚实基础。为探明促进猪PP结内IgA产生的细胞因子及其作用机制,本研究分离并纯化了猪PP结内IgM~+B细胞,将其与T细胞非依赖性细胞因子(BAFF和APRIL)及T细胞依赖性细胞因子(CD40L、TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17A和IL-21)共同培养,检测上清中IgA分泌量。结果表明,CD40L+IL-21可显著促进猪PP结B细胞的IgA产量。深入研究IL-21的作用机制发现,IL-21可促进PP结IgM~+B细胞增殖,抑制其凋亡,从而提高了B细胞的活性;IL-21还可以通过上调IRF4和BLIMP1的表达及下调PAX5和BCL6的表达量来促进B细胞分化为浆细胞;此外,IL-21通过活化JAK-STAT信号通路从而促进IgM~+B细胞发生类别转换重组,形成IgA~+B细胞,最终促进B细胞分泌IgA抗体。为了证实猪PP结内IL-21是否主要来源于滤泡辅助性T(Tfh)细胞,本研究克隆了猪CXCR5的基因,制备了针对其N端54个胞外区氨基酸的多克隆抗体,并表明所制备的兔抗猪CXCR5多克隆抗体具有良好的的反应性和特异性。采用该CXCR5多克隆抗体标记猪外周血淋巴细胞,荧光定量PCR和流式细胞术的结果均表明猪CXCR5主要表达在B细胞中。此外,采用CXCR5多克隆抗体标记并分离了猪PP结内幼稚Th细胞、Tfh细胞和其他活化的非Tfh细胞,荧光定量PCR检测结果表明,猪Tfh细胞是PP结内产IL-21的最主要Th细胞类型。综上所述,本研究首先证明了口服感染结合后海穴注射PEDV可诱导猪肠道IgA的产生;其次,建立了猪IgA类别转换过程中三种关键标志分子(GLTα、PSTα及CTα)的PCR检测方法;最后阐明主要由Tfh细胞产生的IL-21通过JAK-STAT信号通路促进PP结内产IgA的浆细胞的分化,从而促进肠道IgA的产生。该研究丰富了猪肠道黏膜免疫学知识,为设计和创制高效黏膜疫苗提供了理论依据和新的思路。