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研究背景过敏性哮喘是一种由Th2细胞因子分泌引起的复杂的炎症性疾病。传统观点认为,过敏性炎症反应主要是由抗原提呈细胞(APCs)呈递过敏原,进而引起Th2细胞活化而导致的嗜酸性粒细胞炎症,对过敏性哮喘的发展至关重要。而近来研究表明,2型固有淋巴细胞(Group 2 innate lymphoid cells,ILC2s)是过敏性气道炎症早期Th2型细胞因子的主要来源。ILC2s是由来自髓系的一些固有信号和上皮分泌的细胞因子及警报素(如IL-25、IL-33和蛋白酶等)直接激活的,而不需要进一步分化。ILC2s被激活后,可产生大量Th2细胞因子IL-5和IL-13,促进嗜酸性粒细胞炎症反应和气道高反应性(AHR)。一项研究表明,即使缺乏T细胞、B细胞的小鼠在经过木瓜蛋白酶这种过敏原滴鼻致敏后,也能诱导急性过敏性肺部炎症的发生。这表明在过敏性炎症的早期有其他免疫细胞起着关键启始作用。而进一步的研究显示,ILC2s缺乏的小鼠在经过木瓜蛋白酶刺激后,不能诱导小鼠急性Th2型肺部炎症的发生。这些证据表明,ILC2s参与了哮喘的发病机制,并发挥关键作用。因此,调节ILC2s的功能是治疗哮喘的一种理想策略。α7烟碱乙酰胆碱受体(nAChR),可介导快速兴奋性突触传递,是神经精神疾病、神经变性和炎性疾病的潜在治疗靶点。在肺的过敏性炎症中,nAChR的激动剂尼古丁会减弱Th2细胞因子、IgE和半胱氨酰白三烯的水平,从而减少过敏性炎症的发生。然而,nAChR调控过敏性炎症的具体细胞机制尚未明确界定。鉴于它在神经系统疾病以及炎性疾病中的治疗潜力,将α7nAChR作为靶点开发的受体激动剂已用于多种疾病的治疗。其中一些α7nAChR激动剂具有良好的疗效,并已进入临床试验阶段。因此,我们拟选用一种对α7nAChR具有选择性的激动剂PNU-282987,来探讨它在ILC2s介导的过敏性肺部炎症中的作用。研究目的本研究使用IL-33作为经鼻滴入的刺激剂,建立小鼠急性过敏性肺部炎症模型,并在腹腔注射PNU-282987进行干预,以小鼠支气管肺泡灌洗液和肺组织中ILC2的数目变化以及其分泌的2型细胞因子IL-5、IL-13的水平变化情况为检测指标,并通过Real-time PCR检测小鼠肺组织中IL-5、IL-13、GATA3和ST2 mRNA的表达水平变化,来探究PNU-282987是否对ILC2介导的小鼠急性过敏性肺部炎症有抑制作用,从而为过敏性肺部炎症的预防和治疗提供新的依据。实验方法24只6-8周C57BL/6雌性小鼠随机分为PBS对照组、单独PNU-282987组、IL-33模型组、IL-33+PNU-282987干预组;每组6只。实验分别在第1d、2d、3d进行刺激和干预,第5d处死。流式细胞术检测小鼠肺组织以及支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid,BALF)中ILC2s和嗜酸性粒细胞(eosinophils,EOS)的含量。苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)肺组织切片观察各组炎症反应情况,碘酸-雪弗染色(Periodic acid-Schiff regent,PAS)观察气道粘液分泌情况。酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测BALF和肺匀浆上清中IL-5和IL-13的含量。胞内染色法、流式细胞术分析小鼠肺组织中IL-5~+ILC2、IL-13~+ILC2的含量。实时定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测IL-5、IL-13、GATA3和ST2 mRNA的表达水平。实验结果1小鼠肺组织HE及PAS染色的结果PBS对照组染色结果显示:小鼠血管、细支气管周围没有出现大量炎性细胞的浸润、且支气管黏膜处没有大量杯状细胞增生及黏液的分泌;PNU-282987单独用药组染色情况与PBS对照组相似,无明显差异。与PBS对照组相比,IL-33模型组小鼠血管、细支气管周围有大量炎性细胞浸润,且支气管黏膜处有大量杯状细胞增生及黏液的分泌;与IL-33模型组相比,IL-33+PNU-282987干预组小鼠肺组织中仍存在炎性细胞浸润,但浸润程度明显减轻,支气管黏膜处虽仍有杯状细胞增生及黏液的分泌,但黏液分泌情况明显减少。2 ELISA检测小鼠肺匀浆和BALF上清中IL-5和IL-13的结果PNU-282987单独用药组与PBS对照组相比,小鼠肺匀浆和BALF上清中的IL-5、IL-13含量无明显差异(P>0.05)。与PBS对照组相比,IL-33模型组小鼠肺匀浆和BALF上清中的IL-5、IL-13含量均升高(P<0.05);与IL-33模型组相比,IL-33+PNU-282987干预组小鼠肺匀浆和BALF上清中IL-5、IL-13含量均降低(P<0.05)。3流式检测小鼠肺组织及BALF中ILC2s和EOS的结果(1)PNU-282987单独用药组与PBS对照组相比,小鼠肺组织及BALF中ILC2s和EOS占上样总细胞数的百分比和绝对值均无明显差异(P>0.05)。(2)与PBS对照组相比,IL-33模型组小鼠肺组织及BALF中ILC2s和EOS占上样总细胞数的百分比和绝对值均升高(P<0.05)。(3)与IL-33模型组相比,IL-33+PNU-282987干预组小鼠肺组织及BALF中ILC2s和EOS占上样总细胞数的百分比和绝对值均降低(P<0.05)。4胞内染色法分析小鼠肺组织中IL-5~+ILC2、IL-13~+ILC2的结果与IL-33模型组相比,IL-33+PNU-282987干预组小鼠肺组织中IL-5~+ILC2、IL-13~+ILC2的百分比明显降低(P<0.05)。5 Real-time PCR检测小鼠肺IL-5、IL-13、GATA3和ST2的结果PNU-282987单独用药组与PBS对照组相比,小鼠肺组织中IL-5、IL-13、GATA3、ST2 mRNA的相对表达量无明显差异(P>0.05)。与PBS对照组相比,IL-33模型组小鼠肺组织中IL-5、IL-13、GATA3、ST2 mRNA的相对表达量增加(P<0.05);与IL-33模型组相比,IL-33+PNU-282987干预组小鼠肺组织中IL-5、IL-13、GATA3、ST2 mRNA的相对表达量减少(P<0.05)。结论PNU-282987对ILC2介导的过敏性肺部炎症有明显的抑制作用,可减少肺部炎症反应及黏液分泌,减少Th2型细胞因子IL-5,IL-13等的产生。