莲是一种集观赏、药用和食用于一体的水生植物。莲属包含两个物种,即莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)和美洲黄莲(N. lutea Pers.)。两物种虽然间断分布于东亚-北美和澳大利亚北部,但是不存在生殖隔离,杂交可育。除此之外,两物种在形态上差异不明显,最显著的差异是花色。莲具有红色、粉色、白色和红白相间四种花色,独缺黄色,而美洲黄莲只有黄色。有关莲属花色的分子机理非常少,目前仅有红、白花色差异的研究,没有两物种间花色差异的研究。究竟是什么导致了亲缘关系相近的莲与美洲黄莲在花色上差异如此显著?为了解开这个谜底,本研究以黑龙江的野生莲(红色花)和美国佛罗里达州的野生美洲黄莲(黄色花)为材料进行研究。首先,本研究采用分光光度计法测量了红、黄两种花瓣中花青素的含量。然后,通过基因克隆、本地blast和系统发育树的构建,找到在莲属中参与花青素合成及转运的结构基因和调节基因。通过比较这些基因在两物种中的核苷酸序列及转录水平,找到可能参与花色差异的候选基因,并结合酵母双杂和转基因技术进行验证。取得的主要结果如下：(1)野生莲的红色花瓣中花青素的含量较高,而美洲黄莲的黄色花瓣中几乎不含花青素。这表明美洲黄莲花瓣中花青素合成途径可能发生中断。波长扫描显示在350nm处,两种花色的花瓣提取物都有一个高的吸收峰,表明黄酮和黄酮醇存在于这两种提取物中。鉴于黄酮和黄酮醇是在花青素合成途径的中间步骤合成的,因此我们推测美洲黄莲中花青素合成途径的上游基因是有功能的,中断可能发生在花青素合成途径的下游。(2)通过简并PCR技术,从两物种中获得下游基因DFR1和ANS1。基于莲基因组的信息,我们构建本地blast。通过进行本地blast:和构建系统发育树,在莲中鉴定到参与花青素合成的4个UFGTs(UGT78A1-A4)和2个GSTs(GSTF11和GSTF12)基因。以红色花瓣的cDNA为模板进行扩增,检测到了4个UFGT的转录本和1个GST基因(GSTF11)的转录本。通过在两物种中比较这些结构基因的核苷酸序列及推测的氨基酸序列,发现这些结构基因具有较高的同源性,而且在已知的保守区和保守位点中几乎没有氨基酸差异。通过荧光实时定量PCR,发现DFR1、ANSI和UGT78A2在美洲黄莲的黄色花瓣中的表达水平高于莲红色花瓣中的表达水平,而剩下的3个UFGT基因在美洲黄莲花瓣中的表达水平低于莲花瓣中的表达水平。半定量PCR显示莲的花瓣中存在GSTs的转录本,而美洲黄莲的花瓣中不存在GSTs基因的转录本。GSTs基因转录本的缺失可能是美洲黄莲花瓣中不含花青素的关键原因。(3)通过本地blast,从莲基因组中总共鉴定到95个MYB基因,10个bHLH基因和17个WD40基因。通过与其他物种中已报道参与花青素合成的调节基因进行对比并构建系统发育树,我们发现莲中有9个MYB基因,2个bHLH基因和1个WD40基因(即TTG1)基因可能参与花青素合成途径的调控。以红色花瓣的cDNA为模板,通过PCR扩增,我们鉴定到1个MYB基因(即MYB5)和1个bHLH基因(即bHLH1)参与花瓣中花青素合成的调控。序列比较显示,在两物种中TTG1的氨基酸序列是一致的,而bHLH1只有1个氨基酸差异发生在bHLH结构域中。最显著的差异是MYB5基因,由于两个氨基酸的替代形成了一个提前终止密码子。对启动子区域潜在的顺式作用元件进行预测,结果显示美洲黄莲MYB5启动子有14种顺式作用元件,而莲MYB5中有13种。两物种的MYB5基因启动子中都包含很多涉及光响应的顺式作用元件。(4)居群水平上的研究揭示了MYB5基因有3种类型的等位基因。一种为有功能的等位基因,以纯合子的形式存在于莲的8个居群中；第二种为两个核苷酸替代(GAA/TAG)导致形成了一个提前终止密码子；第三种为一个核苷酸缺失导致形成了一个提前终止密码子。这两种无功能的等位基因只存在于美洲黄莲的居群中。其中第二种无义突变的等位基因存在于美洲黄莲的8个居群中,而第三种移码突变的等位基因存在于美洲黄莲的6个居群中。无义突变的等位基因有纯合子形式,而移码突变的等位基因总是和无义突变的等位基因一起,以杂合子形式存在,尚未检测到纯合子形式。(5)酵母双杂实验证明,莲中的NnMYB5不仅可以与莲中的NnbHLH1及NnTTG1互作,也可以与美洲黄莲中的N1bHLH1相互作用。而莲中NnTTGl也可以与两物种中的bHLH1相互作用。以上结果暗示,MYB5、bHLH1和TTG1可以形成MBW三元复合体。NnMYB5与NnbHLH1的相互作用强于与N1bHLH1的相互作用,表明bHLH1在两物种中的差异影响了其与MYB5的互作。(6)NnMYB5基因在拟南芥中的过表达导致花青素在未成熟的种子及花梗中积累,表明NnMYB5是花青素合成的转录激活子。拟南芥AtGsTF12基因在NnMYB5过表达植株中表达水平上调,表明AtGsTF12基因是NnMYB5的靶基因。由上述结果,推测出以下结论：莲与美洲黄莲的红、黄花色差异可能是由于两物种中的MYB5基因编码区的突变影响了其对结构基因的调节,进而影响了结构基因的表达水平与花青素的稳定积累所致。