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由橡胶树白粉菌(Oidium heveae B A.Steinmann)引起的白粉病是橡胶树的重要叶部病害之一,严重影响橡胶的产量。白粉菌属专性寄生菌,尚不能离体培养,转化体系未成熟,导致对橡胶树白粉菌的分子致病机理研究较少。分支酸(Chorismicacid)广泛存在于植物、细菌、真菌及动物体中,是莽草酸代谢途径的最终产物。它参与芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)及次生代谢产物的合成。同时,分支酸还与植物防御相关激素(水杨酸、吲哚乙酸等)的合成有关,在植物抗病中起到非常重要的作用。植物病原物在侵染寄主过程中,能够分泌分支酸变位酶进入植物的细胞质中,影响植物莽草酸途径,从而抑制植物的防卫反应促进病原物的定殖、扩展。本研究克隆和鉴定了橡胶树白粉菌一个分支酸变位酶基因OHCmu,分析其蛋白理化性质,构建GST-OHCmu融合原核表达载体并表达融合蛋白,分析OHCmu酶活和验证了酶活位点,该研究对进一步研究白粉菌OHCmu的分子致病机理具有重要意义,为后续探讨其在病原菌与寄主互作中的作用提供基础。本研究主要结果如下:1、在PDB和NCBI数据库中搜索获得2个不同的分支酸变位酶基因。利用同源比对法,在本实验室已有的橡胶树白粉菌基因组中,搜索获得一个分支酸变位酶同源基因序列。采用RT-PCR法克隆获得橡胶树白粉菌分支酸变位酶基因,命名为OHCmu。该基因大小843 bp,具有1个内含子,其编码262个氨基酸,具有d5csma_结构域,属于Chorismate mutase Ⅱ蛋白家族。通过实时荧光定量PCR验证,结果显示OHCmu基因在白粉菌侵染橡胶叶片过程中,表达量升高,在13h时表达量达最高,随后又逐渐下降。2、构建GST-OHCmu融合原核表达载体,筛选诱导表达条件,并利用GST亲和层析柱对蛋白进行纯化。GST-OHCmu融合蛋白在供试条件(IPTG:0.8 mmol/L,16℃)下可以较好的表达,获得融合蛋白大小约为56 kD,与预测结果一致。经过GST亲和层析柱纯化、切割GST标签后顺利获得浓度较高、较纯的橡胶树白粉菌OHCmu蛋白,大小为30kD。3、通过蛋白酶活测定法分析了 OHCmu的活性,以及温度、产物(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)对酶活的影响。结果显示,纯化后的OHCmu具有分解分支酸的酶活性,同时,其酶活不会受到色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的抑制;但酶活受温度影响,高于45℃酶活几乎完全丧失。4、对OHCmu蛋白进行点突变,验证其关键酶活位点。结果显示第163位精氨酸与173位赖氨酸对OHCmu活性至关重要,是OHCmu的关键酶活位点,与已报道的玉米黑粉菌分支酸变位酶活性位点一致,该酶活位点比较保守。