苹果再植病（ARD）是世界主要苹果产区常见的疾病,严重限制了苹果产业的可持续发展。微生物群落结构失衡被认为是造成ARD的主要原因,而镰孢菌属（Fusarium）是造成我国ARD的主要病原菌之一。在众多改善ARD的措施中,使用抗性砧木被认为是防治ARD的长期有效措施。国外已有大量关于抗ARD砧木的研究,且已在生产中推广,然而目前我国并没有实现抗ARD砧木的大面积繁殖。砧木嫁接亲和性的高低也是评价其是否具有推广应用价值的基础。T337和M26等易受ARD影响的砧木仍是我国苹果生产中的主要砧木,而平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd.）（PYTC）是一种与多数苹果品种嫁接亲和力高,耐ARD的砧木,但由于其不耐盐,不抗旱,未能成为我国苹果产业中的主要砧木。因此,有针对性地选择和培育中国苹果主产区抗ARD的砧木具有十分重要的意义。课题组前期通过原位育种专利技术自选育了一个耐ARD砧木新优系12-2（自命名）,在此基础上,本研究首先将T337、M26和12-2这三种砧木分别栽种到连作土与消毒土中,通过种内比较的方式,连续检测五个月内生物量差值大小的变化,对12-2耐ARD能力进行初步判断;接下来,利用ARD专化型层出镰孢菌MR5（MR5）侵染T337、M26和12-2,进一步探索12-2对ARD有害镰孢菌的耐受性。同时为了检验12-2是否具有推广应用价值,以嫁接亲和性高的PYTC为对照,二者分别与13种不同苹果品种进行嫁接亲和性试验。此外,课题组前期研究表明,苹果连作抗性越低,砧木根系对K+及Ca2+的吸收就越容易受到ARD影响,而且K+通道基因可以通过调控砧木根系对K+的吸收量来提高植物的逆境抗性。因此,本研究以此为切入点,通过对T337、M26和12-2根系净K+和Ca2+流速变化的检测,12-2根系K+通道基因的克隆与功能分析,以期对12-2的连作应答机理进行研究。本研究旨在为苹果砧木抗性育种提供重要的理论依据及试验材料。主要研究结果如下:1.连作对T337、M26和12-2生理指标的影响:与各自的消毒对照相比,连作显著降低了T337和M26的株高、茎粗,部分月份叶片的SPAD和抗氧化酶活性,显著影响了T337和M26部分月份的光合和荧光参数,显著提高了T337和M26部分月份的叶片MDA含量。连作也显著降低了T337和M26部分根系的生长指标和干鲜重,根系活力和根系抗氧化酶活性,显著提高了T337和M26根系MDA含量。12-2中上述生理指标与对照无显著差异,初步判断12-2对ARD具有一定的耐受性。2.MR5侵染对T337、M26和12-2生理指标的影响:侵染试验表明,接种MR5孢子液后,T337、M26和12-2发病率分别为68.00%、100.00%和24.00%。与各自对照相比,M26叶片病斑面积最大,T337次之,12-2最小。MR5侵染显著降低了T337和M26的叶绿素含量、部分光合和荧光参数,显著降低了T337叶片SOD活性和M26的叶片抗氧化酶活性。与各自对照相比,MR5侵染对M26根系造成的损伤最严重,T337根系显示出中等水平的损伤,12-2根系无明显损伤。MR5侵染对T337、M26和12-2的根系结构及干鲜重均无显著影响。MR5侵染显著降低了T337和M26的根系活力和根系抗氧化酶活性（除T337的CAT活性）,显著提高了T337和M26叶片和根系的ROS水平、MDA和渗透物含量。MR5侵染对12-2的上述指标均无显著影响。因此12-2一定程度上可以缓解镰孢菌MR5侵染造成的伤害。3.连作条件下12-2和PYTC嫁接亲和性试验:12-2的嫁接成活率和嫁接口愈合情况与PYTC相比无显著差异。机械强度检测表明,嫁接到12-2上的‘首红’、‘乔纳金’、‘红星’、‘金矮生’和‘乙女’苹果的嫁接口部分机械强度指标显著高于嫁接到PYTC上的对照。对嫁接到12-2和PYTC上的13种苹果砧木的新梢高度、粗度、叶绿素相对含量、光合参数、荧光参数、叶片抗氧化酶活性和叶片MDA含量等生理指标进行检测,与各自对照相比,13种砧穗组合表现存在差异。对这些生理指标结果进行主成分分析表明,‘2001富士’、‘藤牧一号’、‘首红’、‘嘎啦’、‘美国八号’和‘首富1号’苹果在两种砧木上的长势相近,嫁接到12-2上的‘天红2号’、‘绿光’、‘乔纳金’、‘红星’、‘金矮生’、‘乙女’和‘鲁丽’苹果的长势均优于嫁接到PYTC上的对照。由此说明12-2对连作的耐受性优于PYTC。4.连作土提取液对T337、M26和12-2根系不同分区净K+和Ca2+流速的影响:与未浸入连作土提取液（Before-ARD）相比,浸入连作土提取液30 min（ARD-30）处理对T337根系不同分区的净K+和Ca2+流速,M26的根系不同分区的净K+流速及分生区和伸长区的净Ca2+流速,均有显著影响。浸入连作土提取液5 min（ARD-5）处理对12-2根系分生区、伸长区和成熟区的净K+和Ca2+流速也有显著影响,但与ARD-5处理相比,ARD-30处理对12-2根系各分区的净K+和Ca2+流速的影响较小。对砧木不同分区净K+和Ca2+流速变化量的测定表明,T337根系不同分区的净K+和Ca2+流速变化最大的是分生区和伸长区,M26是分生区、伸长区和分生区、成熟区,12-2均是伸长区。因此,12-2在应对连作胁迫时,可以快速调节净K+和Ca2+流速以维持其稳态。5.12-2根系K+通道基因的克隆与功能分析:利用同源克隆方式从12-2中获得了8个K+通道基因:Ms AKT1-1、Ms KAT3-2、Ms KAT1-3、Ms K2P3-4、Ms K2P3-5、Ms K2P5-6、Ms K2P3-7和Ms K2P3-8。它们的长度从942 bp（Ms K2P5-6）到2625 bp（Ms AKT1-1）不等,编码氨基酸的数量从314（Ms K2P5-6）到874（Ms AKT1-1）不等。亚细胞定位预测表明,Ms AKT1-1、Ms KAT3-2和Ms KAT1-3定位于质膜,其余5个K+通道基因定位于液泡和质膜上。8个K+通道蛋白均包含α螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲,有4（Ms KAT1-3）到6（Ms KAT3-2）个跨膜结构,2（5个K2P）到9（Ms AKT1-1）个蛋白结构域。K+通道基因的半定量RT-PCR检测表明它们在根中的表达水平很高。q RT-PCR分析表明,8个基因在MR5胁迫下的相对表达量存在差异。对表达量较高的3个不同家族基因Ms AKT1-1、Ms KAT3-2和Ms K2P3-7进行亚细胞定位表明,3个基因均定位于质膜上。转基因拟南芥验证试验发现,与野生型拟南芥相比,在MR5胁迫下,转基因拟南芥的根长、鲜重、叶绿素a含量、叶绿素b含量和抗氧化酶活性均显著增加,ROS水平、MDA和渗透物含量均显著降低。表明12-2可能通过调控根系K+通道基因表达量来提高12-2对镰孢菌MR5的抗性。