论文部分内容阅读
目的: 1.研究低氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)中容量激活性氯离子通道(CLC3)-mRNA和蛋白表达的变化; 2.观察低氧性大鼠PASMCs增殖和凋亡的变化; 3.探讨低氧状况下大鼠PASMCs中CLC3与MAPK通路之间的关系。 方法: 1.解剖SD雄性大鼠，显微镜下取出肺动脉平滑肌，用组织酶消化法获取PASMCs，进行原代培养。 2.采用普通光学显微镜和免疫荧光染色法，分别鉴定PASMCs。 3.低氧造模:选择生长状态良好且处于对数生长期的4～6代PASMCs，加入无血清培养基将其饥饿24 h，后随机分为7组(n=6):常氧对照组(N)、低氧组(H)、DMSO组(D)、ERK信号转导通路抑制剂U0126组(U)、P38MAPK通路抑制剂SB203580组(S)、茴香霉素Anisomycin即P38MAPK信号转导通路激活剂组(A)、StaurosporineAglycone即ERK信号转导通路激活剂组(SA)。N组加入10％培养基后置于常氧培养箱中，其它各组分别加入含相应药物的10％培养基后置于低氧培养箱(3％O2，5％CO2，37℃)中，造模时间均为48h。 4.造模结束后，分别提取各组细胞总蛋白，用Western-Blot方法测定各组PASMCs中CLC3蛋白的表达。 5.造模结束后，分别提取各组细胞mRNA，用RT-PCR方法测定各组PASMCs中CLC3 mRNA的表达。 6.造模完成后，分别在每个组中加入CCK-8，在450nm处测量各组OD值，时间点分别是30min、1h、2h、4h，借此观察各组PASMCs的增殖情况。 7.PASMCs爬片造模结束以后，采用TUNEL法测定各组中PASMCs的凋亡情况。 结果: 1.CLC3 mRNA表达的变化: ①和常氧组(N)比，低氧组(H) PASMCs中CLC3 mRNA表达上调，差异有统计学意义(P＜0.05); ②与低氧组(H)比较，CLC3mRNA在DMSO组(D) PASMCs中表达变化没有统计学意义(P＞0.05);在U0126组(U)和Anisomycin组(A)两组PASMCs中表达都降低，差异有统计学意义(P＜0.05和P＜0.01);SB203580组(S)与Staurosporine Aglycone组(SA)PASMCs中CLC3 mRNA表达均上调，差异有统计学意义(P＜0.05)。 2.CLC3蛋白表达的变化: ①与常氧组(N)相比，CLC3蛋白在低氧组(H) PASMCs中的表达升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 ②与低氧组(H)比较，CLC3蛋白在DMSO组(D) PASMCs中表达变化没有统计学意义(P＞0.05);在U0126组(U)和Anisomycin组(A)两组PASMCs中表达均降低，差别有统计学意义(P＜0.05和P＜0.01);SB203580组(S)与Staurosporine Aglycone组(SA)PASMCs中CLC3蛋白表达均上调，差别有统计学意义(P＜0.05和P＜0.01)。 3.各组PASMCs增殖情况: ①与常氧组(N)相比，低氧组(H) PASMCs的OD值显著上调，差异有统计学意义(P＜0.01); ②与低氧组(H)相比，DMSO组(D) PASMCs的OD值无显著变化(P＞0.05);U0126组(U)与茴香霉素Anisomycin组(A)两组PASMCs的OD值均下降，差异有显著统计学意义(P＜0.01);SB203580组(S)与Staurosporine Aglycone组(SA) PASMCs OD值均上调，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。 4.各组PASMCs凋亡情况: ①与常氧组(N)比，低氧组(H) PASMCs凋亡指数变化没有统计学意义(P＞0.05)。 ②与低氧组(H)相比，DMSO组(D) PASMCs凋亡指数无明显变化(P＞0.05);U0126组(U)与茴香霉素Anisomycin组(A)两组 PASMCs的凋亡指数均升高，差异有显著统计学意义(P＜0.01);SB203580组(S)与Staurosporine Aglycone组(SA) PASMCs凋亡指数均下调，差异有明显的统计学意义(P＜0.01)。 结论: 1.在低氧条件下PASMCs中CLC3的表达升高，PASMCs活性增强，但其凋亡情况却并无明显的改变; 2.U0126-即ERK1/2的通路抑制剂可以使能低氧性PASMCs中CLC3的表达降低，Staurosporine Aglycone-即ERK1/2信号转导通路的激活剂可以使PASMCs中CLC3的表达水平升高。提示低氧可通过激活PASMCs中的ERK1/2使CLC3的表达增加; 3.SB203580-即P38MAPK信号转导通路的抑制剂可以使CLC3在PASMCs中的表达升高，茴香霉素Anisomycin-即P38MAPK信号转导通路的激活剂可以使CLC3在PASMCs中的表达水平降低，说明低氧会通过激活PASMCs中的P38MAPK使CLC3的表达下降; 4.U0126-即ERK1/2信号转导通路的抑制剂可使低氧性PASMCs活性下降、凋亡增多，Staurosporine Aglycone-即ERK1/2信号转导通路的激活剂可使低氧性PASMCs活性增加、凋亡减少，表明低氧对PASMCs增殖和凋亡的调控可通过激活ERK1/2来实现; 5.SB203580-即P38MAPK信号转导通路的抑制剂可使低氧性PASMCs活性增加、凋亡减少，茴香霉素Anisomycin-即P38MAPK信号转导通路的激活剂可使低氧性PASMCs活性降低、凋亡增加，表明低氧对PASMCs增殖和凋亡的调控可通过激活P38MAPK来实现。