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本研究首先发现NKG2D的配体MICA和MICB广泛表达于非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的肿瘤组织和正常组织中,且其在NSCLC组织中的表达与病理分型以及性别有关,而与吸烟或TNM分期无关；其次,发现MICA的mRNA表达在正常组织高于NSCLC组织中,而MICB表达在二者中无明显差异,但在NSCLC组织中MICA/B蛋白表达显著高于正常组织；进一步发现正常组织相对肿瘤组织中高表达miRNA-20a,其可有效抑制MICA和MICB的转录后翻译,维持正常组织中MICA/B的蛋白处于较低水平；再次,发现不仅NSCLC组织中MICA的mRNA表达与性别相关,而且NSCLC患者血清中MICA蛋白水平也与雌二醇水平正相关。雌二醇可上调NSCLC细胞系中MICA和MICB的mRNA水平及促进MICA和MICB的分泌,雌二醇还可通过上调ADAM17的表达促进MICA/B分泌,导致NSCLC细胞的免疫逃逸。本研究揭示了MICA/B蛋白水平高表达与NSCLC的发展及性别关系,发现miRNA-20a介导MICA/B蛋白表达水平的调控,还发现雌二醇可促进MICA/B分泌,提示雌二醇可能在NSCLC的免疫逃逸过程中发挥重要作用。1、NKG2D配体在非小细胞组织中的表达分析NKG2D(Nature killer group2, member D)作为一种激活型免疫受体,广泛表达于NK细胞、CD8+杀伤T和γδ-T c细胞表面,NKG2D-NKG2DL信号通路在肿瘤免疫监视中发挥重要作用。目前为止,人体中发现有八种NKG2D的配体,分别属于MIC (MICA和MICB)和ULBPs (ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、RAET1G和RAET1L)。 NKG2D配体广泛表达于肿瘤细胞系和原代肿瘤细胞中,而很少在正常细胞中表达。利用PCR检测NSCLC组织和正常组织中NKG2D配体的表达,结果显示MICA和MICB为正常组织和NSCLC组织中主要表达的两种NKG2D配体,ULBP1-4在正常组织和NSCLC组织中很少表达或不表达。虽然在正常组织和NSCLC组织中均检测到MICA和MICB的mRNA表达,但正常组织中MICA/B蛋白处于低水平,而NSCLC组织中MICA/B的蛋白表达明显高于正常组织。将NSCLC组织按不同分类方式进行分类,包括病理类型、性别、吸烟与否以及TNM分期。发现MICA/B在肺腺癌组织中的表达明显高于鳞状细胞癌肺癌；且在女性患者NSCLC组织中MICA和MICB的表达也明显高于男性患者；而MICA和MICB的表达与吸烟与否和TNM分期无关。2、miRNA-20a调控MICA/B的表达前期结果显示MICA和MICB的mRNA在正常组织和NSCLC组织中均表达,且MICA的mRNA表达在正常组织高于NSCLC组织中,而MICB表达在二者中无明显差异。免疫组化分析却发现正常组织中MICA/B蛋白低水平的表达,而NSCLC组织中MICA/B蛋白高水平的表达。因此我们推测是否存在一种转录后调控机制抑制了正常组织中MICA/B的蛋白水平表达。miRNA作为一种内源性的具有调控功能的非编码RNA,其在体内通过剪切加工后,可通过相关蛋白介导靶向mRNA,以降解靶mRNA分子的降解或阻遏mRNA的翻译。利用miRNA芯片技术我们筛选出正常组织和NSCLC组织中差异表达的miRNAs。并通过在线数据库TargetScan我们分析可能与MICA和MICB3’UTR作用的miRNA。结果发现在正常组织中高表达的miRNA-20a,其在MICA3’UTR和MICB3’UTR有结合位点。为进一步为确认miRNA-20a与MICA3’UTR和MICB3’UTR的作用,我们构建了含有MICA和MICB3’UTR的荧光报告质粒。通过共转染293T细胞发现miRNA-20a可调控荧光素酶的表达。同时我们在不同的肺癌细胞系中分别高表达或低表达miRNA-20a。流式细胞仪检测发现在高表达miRNA-20a的条件下,膜表面MICA/B表达下调；而低表达miRNA-20a时,膜表面MICA/B上调。因此,miRNA-20a可能是在正常组织中抑制MICA和MICB转录后翻译的方式之一。3、雌二醇促进MICA/B介导的非小细胞肺癌的免疫逃逸MICA和MICB是NSCLC组织主要表达的两种NKG2D配体,并且其在NSCLC组织中的表达与患者的性别相关。在女性NSCLC患者组织中MICA的mRNA表达显高于男性患者。实验室前期研究发现ERp在NSCLC细胞的增殖、凋亡以及间质转化方面发挥重要作用。因此,我们推测是否雌二醇在NSCLC细胞的免疫逃逸过程中也发挥一定的功能。我们分析了NSCLC患者血清中MICA和雌二醇的表达水平,发现二者之间存在正相关性。并用免疫组化分析发现在NSCLC组织中Aromatase表达水平也与MICA/B蛋白水平正相关。在体外我们利用雌二醇处理NSCLC细胞,结果发现雌二醇可以上调MICA和MICB的mRNA表达,然而其膜上MICA/B的表达呈现动态变化过程。加入抑制MICA/B分泌的抑制剂MICA/B,我们发现在雌二醇处理条件下MICA/B在细胞膜上表达确实升高。利用雌二醇预处理后的肿瘤上清与NK92细胞共培养时,我们发现NK92细胞表面NKG2D表达下调,而CD107a的表达变化与雌二醇预处理与否无关。进一步我们发现在雌二醇处理条件下ADAM17的表达明显上调,其可促进MICA/B的分泌。因此,雌二醇可以促进MICA和MICB的表达,并且通过上调ADAM17的表达促进MICA/B的分泌,以协助NSCLC细胞逃脱NKG2D-NKG2DL介导的免疫反应。