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乳腺癌为女性最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年约有120万人新患乳腺癌,约50万人死于乳腺癌。近年来,在我国城市地区的乳腺癌发病率和死亡率也呈明显上升趋势。乳腺癌是一种全身性疾病,术后复发转移率高,即使处于癌症早期,也有潜在转移的可能性。当乳腺癌发生转移时,目前无特效治疗方法,以死亡为转归。因此,探讨肿瘤发病机制,寻找新的治疗靶点,及可用于诊断和预后判断的生物标志物,是当今肿瘤学研究的重要内容。HER2/neu是一种重要的原癌基因,其表达产物属于EGF受体家庭2号成员。该家族共有4名成员,分别为HER1、HER2、HER3和HER4,各成员具有相似的分子结构和功能。EGF受体家族成员通过配体形成同源或异源二聚体,活化胞内酪氨酸激酶,从而激活信号转导通路。EGFR家族介导的胞内信号途径主要有4条,调控细胞的增殖、分化、迁移、粘附、存活及凋亡等uPAR为尿激酶纤溶酶原受体,是一种高度糖基化膜蛋白,由糖基化磷脂酰肌醇( GPI )锚定在细胞膜表面。uPAR在多种细胞和组织中表达,包括肿瘤组织及其细胞系。在肿瘤细胞中,uPAR的过表达预示肿瘤的恶性程度高和不良预后。uPAR是一个多功能的细胞表面分子,不但,能在细胞表面富集uPA,激活纤溶酶原系统,引起细胞外基质(ECM)蛋白水解,促进细胞转移与侵袭,而且,还能与细胞表面其它分子,如整合素和甲酰甲硫氨酸受体及玻璃粘连蛋白等相互作用,调控细胞粘附、增殖、凋亡、以及肿瘤休眠过等过程。Herceptin是一种针对HER2的人源化单克隆抗体,能够特异性识别HER2蛋白的胞外功能区,抑制其介导的信号传导通路。Herceptin是美国FDA批准的第一种分子靶向药物,为乳腺癌尤其是HER2过表达乳腺癌的临床治疗带来了新的突破。临床研究证实,Herceptin主要应用于HER2基因过表达的乳腺癌患者群。Herceptin单独使用对HER2基因扩增的患者有效率约25%,与化疗药物联用有效率为50%左右。患者使用Herceptin治疗后,平均能够延长1年左右的生存期。但是,对HER2基因低表达乳腺癌患者群,疗效较差。先前的研究显示,HER2和uPAR在表达上存在相互影响作用。所以,本研究利用RNA干扰技术初步探讨HER2与uPAR在表达上是否存在相互调控关系;并在体外和体内水平进一步研究了以HER2和uPAR为靶标,对乳腺癌协同治疗。(1)以人HER2和uPAR基因为靶基因,设计和构建了分别单独针对HER2与uPAR基因的RNAi表达载体(pHER2和puPAR)和同时针对HER2和uPAR基因的RNAi表达载体(pHu),将其转染乳腺癌细胞,并用real time PCR和western blotting检测其抑制靶基因表达的效果。结果显示,我们成功构建的RNAi表达载体,并证实其在乳腺癌细胞中能高效抑制靶基因的表达。(2)将重组RNAi表达载体转染乳腺癌细胞,用real time PCR、western blotting和IF同时检测每个转染组中两种靶基因的表达情况,从而,探讨HER2与uPAR在表达上的相互关系。结果显示,将重组质粒pHER2转染细胞时,不但能高效抑制HER2表达,同时能够部分的抑制uPAR的表达;同样,将puPAR转染细胞时,不但能高效抑制uPAR表达,同时能够部分的抑制HER2的表达;将pHu转染乳腺癌细胞,与pHER2和puPAR相比,对HER2或uPAR基因的表达抑制作用更为显著。(3)利用RNA干扰技术单独或同时抑制HER2和uPAR基因的表达,并检测其对乳腺癌细胞增殖、凋亡、周期、侵袭力以及MAPK信号调控通路活化的影响。结果显示,单独或同时敲降HER2和uPAR基因在乳腺癌细胞中的表达时,都能抑制细胞的增殖、促进细胞的凋亡、降低细胞的侵袭力、抑制MAPK信号通路的活化以及使乳腺癌细胞G0/G1发生阻滞。同时敲降HER2和uPAR基因表达与单独敲降HER2或uPAR基因表达相比,其效果更为显著。(4)将Herceptin和puPAR单独或联合用药,在细胞水平探讨其对乳腺癌细胞增殖、凋亡、周期、侵袭力以及MAPK信号调控通路活化的影响。结果显示,将Herceptin和puPAR单独或联合处理乳腺癌细胞时,都能抑制细胞的增殖、促进细胞的凋亡、降低细胞的侵袭力、抑制MAPK信号通路的活化以及使乳腺癌细胞G0/G1发生阻滞。联合用药与单独用药相比,其效果更为显著。(5)将Herceptin和puPAR单独或联合用药,在体内水平探讨其对荷瘤鼠的治疗作用。动物试验表明,Herceptin对HER2低表达、uPAR高表达型肿瘤治疗作用不明显,puPAR对肿瘤的生长有很好的抑制作用。当Herceptin与puPAR联合用药时,对荷瘤鼠有更为显著的治疗作用。综上所述,本研究初步证实HER2和uPAR在表达上确实存在调控关系。同时敲降HER2和uPAR基因表达与单独敲降HER2与uPAR表达相比,对抑制细胞的增殖、促进细胞的凋亡和降低细胞的侵袭力等具有叠加或协同作用。体外和体内试验证实,敲降uPAR基因能够提高乳腺癌细胞对Herceptin治疗的敏感性。