论文部分内容阅读
植物内生细菌是指能定殖于健康植物组织内部,并与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物。植物内生细菌具有促进植物生长,提高植物抗逆性等能力。目前,植物内生细菌的研究现已成为国内外研究的一大热点。利用小麦内生细菌防治植物土传病害逐渐以安全、有效等优点得到各国植病学家的广泛关注。生防菌生防机理的研究有助于开发稳定、高效、易保存的生防制剂,为大田应用奠定理论基础。分离生防相关基因,从分子水平上研究基因的功能,是阐述生防菌的生防机理的重要途径。本研究中所用的小麦全蚀病内生生防菌Serratia proteamaculans 336X是由本实验室从小麦根部分离得到的革兰氏阴性细菌,对小麦全蚀病的防效可达85%。内生生防菌336X具有产几丁质酶、蛋白酶等病原菌细胞壁降解酶的能力,也可以通过产生N-乙酰-高丝氨酸内酯(AHL)群体感应信号分子形成生物薄膜、铁载体、诱导系统抗性等途径发挥生防作用,并且能够在小麦根部高效定殖,具有运动性和趋化性等生防相关特征。为了研究内生生防菌336X的生防相关基因的功能,从而深入了解其发挥生防作用的分子机制,本研究从两个方向出发,一方面通过利用果聚糖蔗糖酶编码基因sacB表达时336X菌株对蔗糖的敏感性作为反向选择标记,构建小麦内生生防菌336X的环状载体遗传敲除体系,对与内生菌336X发挥生防作用相关的鞭毛运动性基因motA进行基因敲除,最后得到了4个motA基因的敲除突变株。同时,利用该方法对与336X菌株中趋化性相关基因CheW进行基因敲除,最后得到了3个CheW基因的敲除突变株,为该体系的可行性提供了有力的证据。另一方面,利用Red重组系统构建了小麦内生生防菌336X的线性载体遗传敲除体系。首先对内生生防菌336X进行了遗传改造,得到了工程菌336X-1,使得线性载体在336X-1中能够发生同源重组,并对工程菌336X-1进行了温度敏感性测定。进一步构建了内生菌336X产几丁质酶相关基因chiA的线性打靶基因片段C1-Km-C1,通过电击转化的方法将以上线性打靶基因片段导入到工程菌336X-1中,得到了2个几丁质酶A基因的敲除突变株。同时,构建了内生菌336X假定的植酸酶基因的线性打靶基因片段phy-Km-phy,利用该方法进行基因敲除,最后得到了4个phy因的敲除突变株,为该体系的可行性提供了有力的证据。最后,对两种敲除体系进行了比较,分析了它们各自的优缺点。以上研究为研究内生生防菌336X的生防相关基因的功能,进一步认识其生防作用的分子机制奠定了理论基础。