论文部分内容阅读
第一部分PI3K／AKT／GSK3β信号通路在紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡中作用的研究目的通过应用糖原合酶激酶-3β的特异性抑制剂LiCl和PI3K抑制剂LY294002，探讨PI3K／AKT／GSK3β信号通路在紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡和周期阻滞中的作用。方法1、蛋白质印迹法检测抑制剂LiCl对GSK3β磷酸化水平的影响及对Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x1和Mcl-1表达的影响。2、细胞凋亡的检测：AnnexinV-FITC／PI凋亡检测试剂盒检测紫杉醇和LiCl作用下卵巢癌细胞的凋亡率；Hochest33342染色检测各组细胞凋亡形态学变化；蛋白质印迹法检测凋亡执行分子Caspase 9和Caspase 3的剪切情况。3、应用线粒体跨膜电位指示剂JC-1对各组细胞进行染色，荧光显微镜观察不同的凋亡程度下荧光的变化情况。4、应用线粒体提取试剂盒提取各组细胞的线粒体，蛋白质印迹法检测抑制剂LiCl对Bax线粒体转位的影响。5、细胞免疫荧光法检测紫杉醇对Bax蛋白表达和分布的影响。6、PI染色流式细胞仪检测LY294002和LiCl对紫杉醇诱导周期阻滞的影响。结果1、蛋白印迹实验结果显示，浓度增加的紫杉醇90 nM、300 nM和1μM作用OV2008细胞24h后，可上调GSK3β的磷酸化水平，而总的GSK3β蛋白表达无明显变化；LiCl可明显增加GSK3β的磷酸化水平，而总体GSK3β表达无明显变化。2、细胞凋亡的检测结果：各组细胞分别进行AnnexinV-FITC／PI凋亡染色，流式检测结果显示，LiCl预孵育后，梯度浓度紫杉醇作用细胞24h后的细胞凋亡率由26．77％，27．35％，32．28％下降为17．82％，20．17％，18．96％；Hochester33342染色结果显示，LiCl可抑制紫杉醇导致的细胞核形态学变化；蛋白质印迹结果显示，LiCl可抑制Caspase 9和Caspase 3的分子剪切，从而抑制凋亡的发生。3、线粒体跨膜电位指示剂JC-1染色结果显示，抑制剂LiCl可维持卵巢癌细胞OV2008线粒体的极化状态下红绿荧光的强度，阻抑紫杉醇诱导的线粒体去极化所导致的红色荧光减弱。4、细胞免疫荧光和线粒体提取试剂盒提取各组卵巢癌细胞线粒体后的蛋白质印迹结果显示，抑制剂LiCl可抑制紫杉醇导致的Bax蛋白的线粒体转位，并且抑制紫杉醇诱导的抗凋亡分子Bcl-2、Bcl-x1和Mcl-1的降解，上调其表达。5、流式细胞仪周期分析显示，紫杉醇作用后可引起明显的G2M期阻滞（69．33％），而LiCl预孵育的细胞G2M期阻滞明显增加（88．13％），紫杉醇与PI3K抑制剂LY294002（20μM）合用后则可明显降低其G2M期阻滞（44．06％）。6、蛋白质印迹结果显示，应用RNA干扰降低AKT2表达或应用LY294002降低AKT活性均可增强紫杉醇诱导的卵巢癌细胞凋亡。结论1、GSK3β高水平磷酸化可抑制紫杉醇诱导的卵巢癌细胞凋亡。2、磷酸化GSK3β可抑制紫杉醇诱导的Bax蛋白的线粒体转位和抗凋亡分子Bcl-2、Bcl-x1和Mcl-1的降解，从而维持线粒体的稳定，抑制凋亡。3、GSK3β可通过调节Cyclin B1和CDC2影响紫杉醇诱导的G2M期阻滞。第二部分PI3K／AKT／GSK3β信号通路在顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡中作用的研究目的探讨增加GSK3β的磷酸化状态在顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡中的作用。方法运用GSK3β特异性抑制剂LiCl增加GSK3β磷酸化水平，应用流式细胞仪检测浓度梯度增加的顺铂诱导的两株卵巢癌细胞凋亡情况，以及LY294002和LiCl对顺铂诱导细胞周期阻滞的影响；Western Blot检测GSK3β及磷酸化GSK3β蛋白的表达。结果Western Blot结果显示，梯度浓度增加的顺铂（40μM、80μM及120μM）可导致GSK3β磷酸化水平不断增加；Western Blot结果显示，抑制剂LiCl作用后，磷酸化GSK3β水平明显增加；流式结果显示，梯度增加的顺铂作用于0V2008细胞24h，其凋亡率不断增加，分别为3．34％、23．48％和55．17％，而应用LiCl抑制剂预孵育的细胞，不同浓度顺铂作用24h后凋亡率分别为1．21％、16．09％和21．73％；而在另一株卵巢癌细胞SKOV3中，40μM、80μM及120μM作用24h后凋亡率分别为24．98％、53．34％和64．93％，而LiCl预孵育后，细胞凋亡率明显降低为13．94％、20．65％和35．75％。流式细胞周期分析结果显示，顺铂作用后可引起OV2008明显的S期阻滞（83．1 8％），而LY294002则可明显改善细胞S期阻滞（9．96％），且呈现轻度G2M期阻滞（22．75％）；LiCl也可部分改善细胞的S期阻滞（39．55％）。结论GSK3β磷酸化水平增加可抑制顺铂诱导的卵巢癌细胞的凋亡。