牛支原体（M.bovis）隶属于柔膜体纲,支原体目,支原体属,没有细胞壁,大小为0.2⁰.3μm,能通过0.45μm滤膜。支原体基因组只有大肠杆菌的1/5,GC含量约占27.8%-32.9%。感染牛的常见支原体包括牛支原体、牛鼻支原体、牛生殖道支原体、牛眼支原体、牛无乳支原体、丝状支原体丝状亚种（引起牛肺疫）、加利福尼亚支原体、精氨酸支原体、解脲支原体、加拿大支原体、殊异支原体、产碱支原体、里奇氏支原体等等。其中能引起牛乳房炎的支原体病原主要为牛支原体、加拿大支原体、产碱支原体、牛无乳支原体和加利福尼亚支原体。牛支原体、殊异支原体、解脲支原体和丝状支原体丝状亚种均能引起牛肺炎。牛感染后牛支原体后以坏死性肺炎为特征,并能造成乳腺、角膜、关节、生殖道等部位炎症,也能引起母牛流产。M.bovis呈全球流行,并对养牛业造成极大经济损失。国内报道该病的流行始于2008年,随后多地发现此疫情。分离病原、血清学和基因诊断为确诊该病原的主要方式。ELISA检测是目前常有的诊断方法,在实践中应用广泛。目前牛支原体血清学检测研发的主要方向为采用重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法。目前国内还没有商品化ELISA检测试剂盒,国外比利时、加拿大已经研制出商品化检测试剂盒,但是效果还有待验证。实时荧光定量PCR（FQ-PCR）技术,即在PCR体系中加入荧光染料或荧光基团,通过检测PCR扩增反应产生的荧光信号,从而达到定性及定量的分析样本的目的。该方法与普通PCR相比,灵敏性、特异性、重复性都得到了提高。环介导恒温扩增（LAMP）是60-65℃恒温条件扩增目的基因的方法。该方法具有简便、快速、精确、低价的特点,外在条件仅需要恒温水浴锅就可完成反应,灵敏度、特异性上不低于PCR技术,成本上低于Real-time PCR,广泛用于疾病的诊断、检测等领域。研究目的:通过对本研究分离株TL2016部分基因的扩增、比对,研究不同分离株的差异;建立M.bovis抗体间接ELISA检测方法、M.bovis FQ-PCR检测方法和LAMP方法,为M.bovis诊断、流行病调查、抗体检测提供快速、敏感的检测手段。研究内容:1.M.bovis的分离与鉴定。2.M.bovis抗体间接ELISA检测方法的建立与应用研究。3.M.bovis绝对荧光定量PCR检测方法的建立与评价研究。4.M.bovis LAMP检测方法的建立与评价研究。研究方法:1.M.bovis的分离与鉴定对通辽地区采集的牛肺脏病料进行病原分离,对分离病原的16S rRNA、P48、P81基因克隆、测序、对比,比较不同分离株序列的差异性,以及通过药敏实验,为确诊病原和临床诊断及治疗提供理论依据。2.M.bovis抗体间接ELISA检测方法的建立与应用研究。利用生物信息学软件分析P48蛋白的主要抗原位点,优化合成P48基因,扩增出编码P48蛋白主要抗原位点基因片段,克隆至表达载体pET-32a（+）中,并进行诱导表达、鉴定与纯化,以表达的P48全蛋白及主要抗原位点蛋白为包被抗原进行间接ELISA检测,为M.bovis抗体检测试剂盒的研发和应用奠定基础。3.M.bovis绝对荧光定量PCR检测方法的建立与评价研究。通过对M.bovis P81基因组序列分析,筛选出一段特异性区域,并以此区域设计、合成一对FQ-PCR引物。以pMD18-T-P81质粒为Real-time PCR的模板,稀释为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10 copies/μL标准品,进行Real-time PCR扩增。对建立的Real-time PCR方法进行特异性、敏感性、重复性评价。4.M.bovis LAMP检测方法的建立与评价研究。根据牛支原体P81基因71 bp-296 bp的碱基序列之间的6个不同区域设计两对特异性引物,使用LAMP技术,检测M.bovis。对该方法反应条件优化,建立LAMP检测方法。对建立的LAMP方法进行特异性、敏感性和临床样本检测。研究结果:1.于2016年从5份病牛肺脏中分离出一株牛支原体,命名为TL2016。对TL2016株16S rRNA、P81、P48三个基因的扩增、序列比对发现,牛支原体间16S rRNA基因同源性达到99.9%;国内毒株P81基因同源性高达99.9%,和美国标准株同源性94.8%;国内外P48基因高度保守,同源性为100%。药敏实验发现TL2016株对卡那霉素、左氟沙星、大观霉素、环丙沙星、氧氟沙星极敏感;对四环素和氯霉素高度敏感;对妥布霉素、链霉素、多粘菌素、庆大霉素、阿米卡星、复方新诺明、红霉素耐药。2.成功构建原核表达质粒pET-32a-P48（28-185）、pET-32a-P48（221-455）、pET-32a-P48,并且构建的质粒均大量表达目的蛋白。纯化重组蛋白的Western blot鉴定发现,pET-32a-P48（28-185）、pET-32a-P48（221-455）、pET-32a-P48重组蛋白大小分别为32 kDa、39 kDa、60 kDa。P48（221-455）蛋白比P48（28-185）蛋白、P48蛋白的P/N值敏感性更高,用此蛋白建立ELISA检测方法。ELISA最佳工作条件:5%马血清封闭时间1 h,血清孵育时间1 h,HRP标记的兔抗牛IgG稀释倍数1:2000。TMB室温显色15 min,2 M H₂SO₄终止显色。该方法批内和批间CV值均小于7%,与现有商品化检测试剂盒（加拿大）对40份临床血清检测发现,阳性符合率90.9%,阴性符合率93.1%,平均符合率92.5%。3.根据牛支原体P81基因,成功建立了绝对定量检测方法。建立的Real-time PCR最低检出浓度为10 copies/μL,比普通PCR高1000倍;标准曲线的相关系数为0.995,相关性良好;批内批间变异系数均小于1.5%,重复性较好。在相同条件下扩增牛支原体、牛无乳支原体、丝状支原体丝状亚种小克隆、多杀性巴氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、牛肺炎链球菌、溶血性曼氏杆菌基因组,模板为牛支原体基因组时,有荧光信号,其余对照基因组没有荧光信号,表明建立的Real-time PCR特异性良好。4.根据牛支原体P81基因,成功建立了LAMP检测方法。建立的LAMP最低检出浓度为10³ copies/μL,比普通PCR高10倍。LAMP最佳反应条件:25μL体系中Bst聚合酶0.20μL,64℃扩增,扩增时间40 min。实验发现:镁离子和甜菜碱浓度改变对结果影响不大。在相同条件下扩增牛支原体、牛无乳支原体、丝状支原体丝状亚种小克隆、多杀性巴氏杆菌、化脓性隐秘杆菌、牛肺炎链球菌、溶血性曼氏杆菌基因组,模板为牛支原体基因组时,有梯形条带,其余对照基因组无条带,表明建立的LAMP检测方法特异性良好。研究结论:1.成功于牛肺脏分离出一株牛支原体,序列比对发现牛支原体间16S rRNA基因同源性达到99.9%,P48基因同源性为100%,P81基因同源性94.8-99.9%。药敏实验发现牛支原体对卡那霉素、左氟沙星、大观霉素、环丙沙星、氧氟沙星、四环素和氯霉素高度敏感。2.成功表达、纯化pET-32a-P48（28-185）、pET-32a-P48（221-455）、pET-32a-P48蛋白。鉴定发现P48（221-455）蛋白P/N值敏感性更高,用此蛋白建立ELISA检测方法。该方法特异性、敏感性、重复性都很好,与商品化试剂盒符合率较高。3.根据牛支原体P81基因,成功建立了绝对定量检测方法。建立的Real-time PCR变异系数小于1.5%,具有很好的准确性、重复性和特异性。4.根据牛支原体P81基因,成功建立了LAMP检测方法。建立的LAMP最低检出浓度为10³ copies/μL,比普通PCR高10倍,并且具有简便、特异等优点。