背景：目前手术、放化疗等传统疗法在进一步提高口腔鳞癌患者5年生存率方面进入了瓶颈期,因此免疫治疗、基因治疗、靶向治疗等生物治疗手段越来越受到临床医生和基础研究者的关注。肿瘤免疫治疗是肿瘤生物治疗的主要手段之一,其目的是激发和增强机体自身免疫能力达到治疗肿瘤。树突状细胞(Dendritic cell, DC)是机体内抗原递呈能力最强的专职抗原提呈细胞,是免疫系统的枢纽。然而许多研究发现肿瘤患者DC数量减少、功能和表型受损。因此体外制备肿瘤DC疫苗回输给肿瘤患者成为研究热点之一。肿瘤DC疫苗发挥抗肿瘤疗效的关键在于DC疫苗能有效迁移到引流淋巴组织,递呈肿瘤抗原给初始T细胞,启动抗肿瘤免疫应答。回输DC在体内向淋巴组织的迁移效率是肿瘤DC疫苗启动抗肿瘤免疫的关键因素。我们的前期研究中用合成的超顺磁氧化铁(Superparamagnetic iron oxide, SPIO)对DC进行标记示踪,发现SPIO对DC有良好的生物相容性,但仅有少数标记后的DC在回输后迁移到引流淋巴结。因此需要进一步研究SPIO对DC在体内迁移效率的影响,明确SPIO是否能够作为临床观察DC疫苗迁移分布的示踪剂。DC疫苗负载的抗原类型是肿瘤DC疫苗启动抗肿瘤免疫的另一关键因素。目前肿瘤冻融裂解物(Lysate)负载DC法是最传统的肿瘤全抗原负载DC的方法,但其疗效尚不尽如人意。自噬是细胞普遍存在的降解受损或无用的大分子维持自稳的生理过程。肿瘤细胞主要通过泛素化-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径降解肿瘤抗原,而能被MHCI类分子直接递呈的抗原肽主要来源于通过蛋白酶体降解的肿瘤抗原(尤其包括有缺陷的核糖体产物,即Defective ribosomal products, DRiPs)。通过自噬诱导剂、蛋白酶体抑制剂、溶酶体抑制剂处理肿瘤细胞,分离出的包含未降解的肿瘤全抗原(包括大量DRiPs)的小泡状自噬体被称为DRibbles (DRiPs in blebs),可作为新型肿瘤抗原。虽然DRibbles在多项研究中被证实是肿瘤抗原的有效携带者,但其中被交叉递呈的肿瘤抗原成分的本质存在争议。而口腔癌细胞系来源DRibbles是否能够作为新型抗原提高DC疫苗对肿瘤的疗效还需进一步研究。DRibbles负载DC疫苗诱导抗肿瘤免疫的机制以及DRibbles疫苗是否需要DC作为载体发挥抗肿瘤作用尚不明确。目的：1.观察SPIO标记的小鼠DC在体内迁移及其效率。2.建立小鼠口腔鳞癌细胞系(SCC7)自噬性抗原(Dribbles)的制备方法并观察其刺激T、B细胞增殖活化的作用。3.评价DRibbles对DC抗原递呈功能的影响并观察其负载DC疫苗对荷瘤C3H/HeJ小鼠的疗效。4.评估DRibbles负载DC疫苗对恶性肿瘤细胞株冲击遗传背景相同小鼠的保护性免疫效果。方法：1.诱导培养小鼠骨髓来源DC,对其纯度进行检测。用不同浓度SPIO标记EGFP-DC,对细胞进行普鲁士蓝染色及平均含铁量测定研究DC对SPIO摄取情况,流式细胞术检测DC表面分子表达、凋亡比例、表达EGFP的荧光强度。不同浓度SPIO标记的EGFP-DC在小鼠足垫注射后24小时,用光学成像、免疫组化、流式细胞术检测引流淋巴结EGFP荧光信号。SPIO标记的EGFP-DC及SPIO未标记的EGFP-DC对小鼠足垫注射后不同时间,用光学成像、免疫组化、流式细胞术检测引流淋巴结EGFP荧光信号。2.小鼠口腔鳞癌细胞系SCC7诱导自噬不同时间,免疫印迹法检测自噬标志分子LC3-Ⅱ的表达。SCC7诱导自噬24小时分离自噬性抗原DRibbles,用透射电镜观察其超微结构、扫描电镜观察其表面形态。SCC7反复冻融法制备Lysate。CCK-8法检测不同浓度DRibbles刺激后脾脏细胞及淋巴结细胞的增殖活力；检测DRibbles或Lysate刺激后脾脏细胞及淋巴结细胞的增殖活力。流式细胞术检测不同浓度DRibbles刺激后脾脏细胞CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、Treg细胞比例；检测DRibbles或Lysate刺激后脾脏及淋巴结B细胞表面标志的表达。不同剂量DRibbles经腹股沟淋巴结注射免疫小鼠7天后,对腹股沟淋巴结细胞计数,流式细胞术检测淋巴结CD4+IFN-γ+T细胞及CD8+IFN-γ+T细胞比例,ELISA检测DRibbles再刺激后腹股沟淋巴结细胞和脾脏细胞培养上清的IFN-γ水平。3.激光共聚焦显微镜观察DC对CFSE标记DRibbles的吞噬。流式细胞术检测不同浓度DRibbles刺激后DC的凋亡比例；检测DRibbles刺激不同时间后DC的凋亡比例；检测DRibbles或Lysate刺激后DC的凋亡比例：检测不同浓度DRibbles刺激后DC表面标志的表达；检测DRibbles或Lysate刺激后DC表面标志的表达。用DRibbles或Lysate负载的DC进行混合淋巴细胞反应,CCK-8法检测不同抗原负载的DC刺激后T细胞的增殖活力。DRibbles或Lysate负载的DC疫苗加强免疫荷瘤小鼠,对小鼠进行生存观察和测量肿瘤大小。4.不同剂量DRibbles负载的DC疫苗加强免疫正常小鼠,流式细胞术检测小鼠PBMC.脾脏细胞、腹股沟淋巴结细胞中CD4+IFN-γ+T细胞及CD8+IFN-γ+T细胞比例；免疫磁珠分选脾脏、淋巴结T细胞用于靶细胞杀伤实验,检测效应T细胞对SCC7的细胞毒性；ELISA检测小鼠血浆及靶细胞杀伤实验中的上清液IFN-γ水平。DRibbles、DRibble-DC、Lysate-DC、DC分别加强免疫小鼠后,用SCC7对小鼠进行冲击,而后对小鼠进行生存观察和测量肿瘤大小；流式细胞术检测小鼠外周血单个核细胞(PBMC)及淋巴结细胞中Treg细胞比例；ELISA检测淋巴结和脾脏细胞经DRibbles再刺激后培养上清IFN-γ水平。结果：1.诱导培养至第7天的小鼠骨髓来源DC中CD11c+细胞比例达80%以上。随着SPIO标记浓度的提高,细胞内含铁量逐渐增加,然而DC表面CD40、CD80、CD86、MHCII类分子、MHCI类分子的表达无显著性变化,CCR7的表达逐渐降低(P＜0.05)；DC的凋亡比例无显著改变；DC的EGFP荧光强度没有显著改变。DC回输小鼠体内后24小时,随着SPIO标记浓度的提高,DC迁移到初级引流淋巴结的效率逐渐降低。SPIO标记EGFP-DC组和未标记的EGFP-DC组在回输后第7天时胭窝淋巴结EGFP+细胞最多,第14天EGFP+细胞减少,但两组间无显著性差异。在第4、7天SPIO标记EGFP-DC组腹股沟淋巴结能检测到EGFP+细胞,而SPIO未标记的EGFP-DC组各时间点腹股沟淋巴结均未能检测到EGFP+细胞。2.SCC7诱导自噬、抑制蛋白酶体活性和溶酶体活性24小时自噬标志分子LC3-Ⅱ的蛋白水平表达上调为对照组的2.82倍,且高于12小时组及显著高于36小时组(P＜0.01)。DRibbles富含大量自噬体结构,直径约200-900nm不等。10μg/ml DRibbles刺激淋巴细胞增殖作用在各浓度组中最强(P<0.001)。DRibbles刺激淋巴细胞增殖作用显著强于Lysate(P<0.001)。10 μg/ml DRibbles刺激后脾脏T细胞比例上调达68.12%,显著高于其他浓度组(P<0.05)：其中CD4+细胞约占41.26%,CD8+细胞约占28.66%,均高于其他浓度组。DRibbles比Lysate更能显著下调脾脏细胞Treg细胞比例至1.08%(P<0.01)。DRibbles比Lysate更能显著上调B细胞表面CD40、CD80、CD86、MHCII类分子的表达(P <0.05)。2.5μg DRibbles经淋巴结注射免疫的小鼠淋巴结细胞CD4+IFN-γ+T细胞比例增加至1.16%,CD8+IFN-γ+T细胞比例增加至0.53%,淋巴结细胞和脾脏细胞再刺激后分泌IFN-γ分别高达1086.45 pg/ml和142.04 pg/ml,均高于其他剂量免疫组。3.共孵育6小时即可观察到大部分DC吞噬了CFSE标记的DRibbles。不同浓度DRibbles和其不同刺激时间对DC凋亡无显著性影响(P>O.05)。DRibbles及Lysate负载DC对其凋亡则无组间显著性差异(P>0.05)。不同浓度DRibbles能显著上调DC表面CD40、CD86、MHCI类分子的表达水平,表达阳性的细胞比例随着DRibbles浓度的加大而逐渐增加。不同浓度DRibbles刺激DC后MHCⅡ类分子的表达则无显著性变化(P>0.05)。与Lysate组和对照组相比,DRibbles负载的DC表达CD40、CD86、MHC I类分子显著上调(P<0.05),而MHCⅡ类分子在各组中的表达无显著差异(P>0.05)。DRibble-DC比Lysate-DC具有更强的在体外刺激T细胞增殖的能力(P<0.05),且加入促成熟因子后这种差异更加显著(P<0.01)。与Lysate-DC及对照组相比,DRibble-DC能显著提高荷瘤小鼠生存率至87.5%,抑制肿瘤生长。4.以2.5μg/ml DRibbles负载的DC疫苗免疫组小鼠脾脏来源T细胞及淋巴结来源T细胞对SCC7的细胞毒性分别高达52.85%和66.14%,均高于其他浓度负载组；血浆IFN-γ水平为7.04 pg/ml,脾脏细胞T细胞及淋巴结T细胞再刺激后上清IFN-γ水平分别为7.59 pg/ml和13.89 pg/ml,均高于其他浓度负载组；PBMC中CD8+IFN-γ+T细胞达3.68%,CD4+IFN-γ+细胞占T细胞的比例达7.35%,脾脏中CD4+IFN-γ+细胞占T细胞的比例达2.19%,淋巴结中CD8+IFN-γ+细胞占T细胞的比例达2.38%,CD4+IFN-γ+田胞占T细胞的比例达5.44%,均高于其他浓度负载组。DRibbles负载的DC疫苗能显著提高肿瘤冲击后小鼠的生存率至90%(P＜0.05),抑制肿瘤生长(P＜0.05),降低PBMC及淋巴结中Treg细胞比例分别至7.04%和8.31%。DRibbles负载的DC疫苗免疫组小鼠淋巴结细胞、脾脏细胞用DRibbles再刺激后分泌工FN-γ,水平分别为862.9 pg/ml和309.5 pg/ml,显著高于其他疫苗免疫组(P<0.05)。结论：1.不同浓度SPIO标记的DC,尽管其含铁量不同,但其表面CD40、CD80、CD86、 MHC Ⅱ、MHC Ⅰ类分子的表达水平尚未见到明显改变,细胞凋亡也无显著差异。虽然从短期(24小时)观察来看,随着SPIO标记浓度的升高,DC表达CCR7比例和迁移到初级引流淋巴结的数量逐渐减少,但从长期(14天)观察来看,SPIO标记的DC与未标记DC迁移到初级引流淋巴结的数量无显著差异,而SPIO标记的DC迁移到次级引流淋巴结的数量则显著高于未标记DC。SPIO标记的DC与未标记DC均在第7天迁移到初级引流淋巴结的数量最多,到第14天数量显著减少。2.建立了小鼠口腔鳞癌细胞系来源DRibbles的制备方法,诱导分离获得的DRibbles富含自噬体。DRibbles作为新型肿瘤抗原,在体外能够刺激淋巴细胞增殖活化,减少抑制性T细胞的比例。DRibbles在低剂量下直接免疫小鼠就能有效诱导细胞免疫反应,但过高剂量的DRibbles直接免疫小鼠诱导的细胞免疫反应强度反而不及低剂量组。3.DRibbles以不同浓度及不同时间刺激DC对其凋亡无显著影响。DRibbles能显著上调DC表面CD40、CD86、MHC Ⅰ类分子的表达,上调程度呈剂量依赖性,对MHCⅡ类分子的表达无显著影响。DRibbles比传统肿瘤冻融裂解抗原更能促进DC递呈抗原,刺激T细胞增殖。与传统的肿瘤裂解物负载的DC疫苗相比,DRibbles负载的DC疫苗能显著提高荷瘤小鼠生存率,抑制肿瘤生长。4.低浓度的DRibbles负载DC疫苗免疫小鼠即可有效的启动抗肿瘤细胞免疫应答,但过高浓度的DRibbles负载DC疫苗启动抗肿瘤免疫应答的效果欠佳。DRibbles负载DC疫苗加强免疫能有效诱导抗肿瘤免疫应答,对小鼠抵御恶性肿瘤细胞的冲击有显著的免疫保护作用。