研究背景和目的:颅内肿瘤是神经科临床工作中非常常见的一类疾病。在所有的脑肿瘤中,原发性脑胶质瘤占到75-80%,是最常见的恶性脑肿瘤。脑胶质瘤导致的脑水肿可以造成脑组织的压迫损伤,引起颅内压增高,最终导致脑缺血、脑疝、和死亡等严重后果。早在20世纪60年代就开始有各种研究尝试运用药物减轻消除脑水肿,如糖皮质激素等,其作用机理及各种药物副作用也逐渐被临床认识到。因此,我们想找到一种对消除脑水肿作用更强,同时更加安全的药物,从而能降低脑胶质瘤患者病死率、致残率,并改善患者预后。脑水肿大致可分为四类,分别是血管源性脑水肿、细胞性脑水肿、渗透压性脑水肿和脑积水性脑水肿。由脑肿瘤直接导致的脑水肿类型主要涉及前两类。血管源性脑水肿的发生机制主要是肿瘤具有占位效应,对瘤周脑组织具有压迫作用,导致血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)受损、破坏,毛细血管通透性增加,水分渗出增多,水分积存于血管周围及细胞间隙所致。同时由于蛋白类物质的渗漏,细胞外液渗透压升高,增加水分的渗出,从而加重脑水肿程度。脑肿瘤导致的细胞性脑水肿则是由于脑肿瘤压迫脑组织,导致脑组织缺血、缺氧,神经细胞膜功能障碍,线粒体三磷酸腺苷(ATP)生成减少,神经细胞膜的钠-钾ATP酶、钙-镁ATP酶等活性降低,细胞内外的钠、钾、钙、镁离子交换障碍,出现细胞内高钠,细胞间隙液高钾的反常现象。同时出现细胞内钙超载,从而出现神经细胞肿胀,细胞内水肿。此两种类型的脑水肿常常共存并相互演变,形成恶性循环。在正常生理情况下,血管内皮细胞及之间的紧密连接是血脑屏障的重要组成部分。紧密连接分子,如紧密连接蛋白3,紧密连接蛋白5和紧密连接蛋白12,以及其它的跨膜蛋白,如occludin等在内皮细胞相互连接方面起到至关重要的作用。完整的血脑屏障可以阻止血管内的液体大量进入脑组织。而脑肿瘤发生后,由于肿瘤快速生长,压迫周围正常脑组织,造成局部缺血缺氧,导致肿瘤周围细胞性水肿的同时,也对周围完整的血脑屏障造成结构性破坏。有研究表明,脑胶质瘤可以通过释放大量的血管内皮生长因子(VEGF)造成血管内皮的紧密连接分子表达异常、出现缺陷,从而导致液体从血管内渗漏,形成脑水肿。此外,水通道蛋白AQP4在脑肿瘤导致的细胞性水肿的形成过程中扮演重要角色。生理情况下水通道蛋白AQP4在血管周围的星形胶质细胞足突密集表达。而在脑胶质瘤组织中,AQP4正常的表达定位不复存在,而是在细胞膜上广泛分散性表达。AQP4的表达上调可以增加神经胶质细胞的透水性,与脑水肿形成的程度高度相关。二甲双胍是一种临床常用的治疗2型糖尿病的降糖药物,药性稳定,副作用较少。大量研究证据表明,二甲双胍除具有降低血糖的作用以外,对血管壁的通透性也具有调节作用。此外,近年来的研究结果还发现二甲双胍在体外可以通过调控水通道蛋白AQP4的表达水平影响星形胶质细胞的透水性。因此,本课题的研究目标是分别通过体外培养内皮细胞和体内脑胶质瘤动物模型的两种方式,评估二甲双胍对脑胶质瘤周围水肿形成的影响,并进一步探讨其可能的机制。方法:为了研究二甲双胍对血管源性脑水肿的调节机制,本实验首先运用体外培养的b End3单层内皮细胞,建立了体外血脑屏障模型。通过测量b End3单层内皮细胞的电阻值,评价二甲双胍对缺氧以及VEGF孵育造成的内皮细胞通透性改变的作用。同时,通过免疫印迹法,观察紧密连接蛋白,如Occluding,Claudin-5,ZO-1和ZO-2在b End3细胞中的表达水平的变化。为了研究二甲双胍对细胞性脑水肿的调节机制,我们建立了星形胶质细胞的体外培养,并进一步观察二甲双胍对星形胶质细胞中的AMPK的激活,NF-κB和AQP4表达的调节作用。最后,通过建立脑胶质瘤水肿的体内动物模型,观察在大鼠体内二甲双胍对脑胶质瘤造成的血管通透性改变的作用,以及对脑胶质瘤周围组织中AQP4表达的影响,初步评价二甲双胍对脑胶质瘤导致的脑水肿的作用。结果:经测定,本实验中培养的b End3细胞模型的电阻值为(341±36)Ω.cm2,所以本实验中的细胞模型符合体外研究血脑屏障通透性的标准要求。通过缺氧以及VEGF孵育的方法,我们发现,二甲双胍可以减轻缺氧或者VEGF孵育造成的内皮细胞通透性增加。进一步的实验发现,缺氧或者VEGF孵育可以降低紧密连接蛋白,如Occluding,Claudin-5,ZO-1和ZO-2在b End3细胞模型中的表达水平。然而,0.5 m M的二甲双胍可以使其表达正常化。因此,我们的实验结果表明,二甲双胍可能通过增加紧密连接蛋白的表达水平,减轻由于缺氧或者VEGF的暴露造成的内皮细胞通透性的升高。脑胶质瘤在生长的过程中,能够分泌大量VEGF以及造成局部缺氧的环境,破坏血脑屏障,诱发血管源性脑水肿。因此,我们的实验结果预示,二甲双胍可以对抗脑胶质瘤生长造成的血管源性脑水肿。然而,脑胶质瘤生长还可能造成细胞性脑水肿,我们的实验进一步阐明了二甲双胍的药理作用还包括对星形胶质细胞的AQP4蛋白表达的调节作用。该调节作用可能是通过激活AMPK,从而抑制NF-κB的活性,来降低VEGF诱导的AQP4的表达上调。由于AQP4的表达量与细胞性脑水肿的形成呈正性相关,因此我们的实验结果预示,二甲双胍可能减轻脑胶质瘤造成的细胞性脑水肿。最后,我们建立了脑胶质瘤水肿的体内动物模型,发现在大鼠体内二甲双胍可以降低C6脑胶质瘤造成的血管通透性增加,下调胶质瘤周围组织中的AQP4的表达,从而降低脑组织中的液体量,抑制或减轻脑水肿的发生。结论:本课题通过体外细胞模型实验和在体动物模型实验发现验证了二甲双胍可以同时减轻血管源性脑水肿和细胞性脑水肿。这预示着二甲双胍可以对抗脑胶质瘤瘤周水肿的形成。对临床上治疗脑胶质瘤可能具有积极的意义。