论文部分内容阅读
在前期工作中,我们以人乳腺癌细胞系MCF-7及人肺腺癌细胞系A-549为研究对象,将两个细胞系各分为10组(接受不同浓度的单药唑来膦酸(zoledronic acid, ZOL)处理)和5组(接受不同浓度的单药紫杉醇(paclitaxel, PTX)处理)，MTT显示：单药ZOL及单药PTX对两个细胞系均有抑制作用；且抑制作用具有浓度依赖性；结合国内外文献和我们的研究结果,得到ZOL与PTX的最适用药浓度分别为100uM和2nM,将最适浓度的ZOL与PTX联合处理两个细胞系,并按给药顺序分为先ZOL后PTX(ZOL→PTX)、先PTX后ZOL(PTX→ZOL)及同时给药(PTX+ZOL)三个组及空白对照组。应用MTT法检测各组细胞抑制率、流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及各组细胞周期变化,通过比较分析各组实验结果得出：ZOL与PTX联合应用时具有协同抑制乳腺癌和肺腺癌细胞系的作用,该作用具有给药顺序依赖性,抑制率最大的给药组为PTX→ZOL组；在细胞周期上,PTX→ZOL组能诱导S期细胞聚集从而将细胞周期阻滞在S期而不能进入G2/M期进行细胞增殖分裂。目的：本实验通过观察联合应用ZOL及PTX对人乳腺癌细胞系MCF-7及肺腺癌细胞系A-549的抑制作用,检测与ZOL和PTX抗肿瘤作用相关的Raf/Mek/Erk和PI3K/Akt信号传导通路的指标变化,进一步探讨两药协同作用的分子机制。方法：以人乳腺癌细胞系MCF-7及人肺腺癌细胞系A-549为研究对象,将两个细胞系各分为4组：①空白对照；②单药ZOL作用24小时(Hour, H);⑧单药PTX作用4H；④先PTX作用4H后ZOL作用24H(PTX→ZOL)。应用Realtime-PCR检测各组Erk和Akt的mRNA水平的变化情况,应用Western blot检测各组Erk、Akt蛋白表达及磷酸化水平和抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达。结果：1、24孔培养板中,MCF-7和A-549细胞的最适细胞密度均为4×104个/ml；6孔培养板中：MCF-7的最适细胞密度为2×105个/ml,A-549的最适细胞密度为3×105个/ml。2、在种植密度相同的情况下,MCF-7细胞较A-549细胞增长快,两者均呈现S形生长曲线。孵育2天后,两个细胞系均可进入对数生长期,选择此时进行加药实验。3、Realtime-PCR检测结果显示,MCF-7和A-549细胞中Erk和Akt的mRNA表达均为：空白对照组最高,单药ZOL组次之,再次为PTX组,PTX→ZOL组最低。4、Western blot检测结果显示：两个细胞系各组中Erk、Akt蛋白表达水平均无差异,但Akt和Erk磷酸化水平为：空白对照组最高,单药ZOL组次之,再次为PTX组,PTX→ZOL组最低。Bcl-2蛋白表达水平亦是：空白对照组最高,单药ZOL组次之,再次为PTX组,PTX→ZOL组最低。结论：唑来膦酸联合紫杉醇可能通过下调Raf/Mek/Erk中Erk基因mRNA的表达,降低Erk磷酸化水平,抑制Erk激酶的活性,进而抑制乳腺癌细胞系MCF-7和肺腺癌细胞系A549的生长和增殖,并可能通过下调PI3K/Akt信号通路中Akt基因mRNA的表达,降低Akt磷酸化水平,进而减弱Akt活性,进一步降低抗凋亡蛋白Bcl-2的水平,起到促凋亡作用。