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[背景]肝纤维化是各种慢性肝病过度到肝硬化甚至肝癌的必经之路,因此尽早进行诊断治疗对于防止疾病恶化、提高患者生存率以及改善患者生活质量具有重要意义。目前大量的文献证实肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化是肝纤维化发生发展的核心环节。当肝脏受到损伤因子刺激时,静息的HSC会激活转变成活化型HSC,自身不断增殖分泌大量ECM,此外还持续释放多种趋化因子损伤周边的肝细胞、枯否细胞等,进一步加剧肝脏病理状态,所以靶向抑制HSC活化已经成为改善以及治疗肝纤维化的关键策略。发掘靶向抑制HSC活化进而缓解肝纤维化进程的安全高效的药物目前是抗肝纤维化治疗领域的研究热点。本课题致力于抗肝纤维化天然产物药物的研究,发现青蒿素及其衍生物具有良好的改善肝纤维化的疗效。而嵩甲醚(Artemether,ART)作为临床一线抗疟药物,开发其抗肝纤维化这一新的药理活性,将为其相关临床疾病的治疗带来曙光。本研究旨在明确蒿甲醚对肝纤维化的改善作用,并阐明其作用机制。本研究实验结果将为ART作为抗肝纤维化药物提供数据支撑,为ART的作用机制以及潜在靶点提供了崭新的思路和方向。[方法]1.临床样本检测从南京中医药大学附属医院获取28例临床肝脏活检、肝硬化以及肝癌患者肝脏样本,免疫荧光、马松染色以及Real-time PCR考察BRD7分子与肝脏疾病进程的关系。2.体内实验80只雄性ICR小鼠随机分成10组(每组8只):正常对照组、CC14造模组、CC14+空转质粒组、ART低剂量组(5 mg/kg)、ART中剂量组(10 mg/kg)、ART高剂量组(20 mg/kg)、ART(10 mg/kg)+ 空转质粒组、BRD7 shRNA组、ART(10 mg/kg)+BRD7 shRNA组、秋水仙碱组。肝脏宏观检查、苏木精-伊红染色、马松染色、天狼星红染色直观考察小鼠肝脏结构变化,谷草转氨酶、谷丙转氨酶以及碱性磷酸酶试剂盒检测评估小鼠肝损伤情况,羟脯氨酸以及肝纤四项(透明质酸、层黏连蛋白、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原)试剂盒检测评估小鼠纤维化程度,Real-time PCR、western blot、免疫组化以及免疫荧光考察小鼠肝脏HSC活化(a-SMA、Fibronectin、Collagen 1)和促纤维化(PDGF-βR、EFGR)指标的水平;此外,免疫荧光以及普鲁士蓝染色观察小鼠肝脏铁死亡的发生。3.体外实验选取人源性肝星状细胞LX2、正常肝细胞LO2、肝癌细胞HepG2以及SMMC7721作为体外研究对象,MTT和台盼蓝染色考察HSC细胞活力以及死亡情况;免疫荧光、western blot、Real-time实验考察HSC活化指标的表达;台盼蓝染色、PGSK染色、电镜观察、试剂盒检测评估HSC铁死亡的发生;Western blot、免疫共沉淀、免疫荧光检测BRD7的蛋白表达以及P53、BRD7分子的结合情况。[结果]临床肝脏样本的马松、免疫荧光染色以及Real-time PCR结果显示与正常肝组织相比,随着肝脏病程加重,BRD7的表达与a-SMA的表达呈现负相关。体内研究结果显示,ART可以显著改善CC14所致的肝脏病理改变、胶原沉积、HSC细胞的活化以及促纤维化因子的表达。机制研究发现,ART可以选择性地促进活化型HSC细胞表达铁死亡关键指标(SLC2A11、Ptgs2、铁离子)并促使其发生铁死亡,这提示ART对肝纤维化的改善作用与其介导HSC细胞铁死亡密切相关。深入机制探讨发现ART可以增强肝脏BRD7的表达,而BRD7 shRNA可以削弱ART促进HSC铁死亡以及抗肝纤维化作用,这表明BRD7分子极有可能是ART发挥功能的关键分子。体外实验结果显示,ART可以剂量依赖性地降低HSC活化指标蛋白以及基因水平的表达。同时,ART可以诱导HSC呈现出铁死亡的表型:铁离子聚集、脂质过氧化物过载、抗氧化系统失调以及线粒体皱缩,使用铁死亡抑制剂Fer-1反向验证证明ART的确通过介导铁死亡抑制HSC活化。深入机制探讨发现ART可以明显提高BRD7的表达,介导BRD7与P53绑定入核并调控下游铁死亡关键因子SLC 7A11的转录表达,进而调节铁死亡进程。而这一作用则能被BRD7干扰显著削弱,结果表明BRD7-P53-SLC7A11通路介导的铁死亡是ART抗肝纤维化的基础。[结论]本研究体内外实验首先证明ART确实具有抗肝纤维化的疗效,而且这一作用与ART诱导活化型HSC发生铁死亡密切相关。此外,通过软件数据分析以及临床样本、小鼠纤维化肝脏样本和细胞实验观察发现BRD7极有可能与纤维化进程呈现负相关。进一步体内外实验验证ART可以促进BRD7的高表达,而且ART诱导的铁死亡依赖于BRD7介导的P53入核。本实验为ART作为抗肝纤维化药物提供数据支撑,而且为靶向BRD7分子抗纤维化治疗提供研究基础。