[目的]结直肠癌是全球范围内最常见的恶性消化道肿瘤之一。目前的治疗措施是以手术、放疗和化疗为主的综合治疗,对于早期的结直肠癌有较好的治疗效果,但中晚期结直肠癌的复发率和死亡率仍居高不下,迫切需要研究建立疗效好、特异性高的治疗技术。靶向治疗是近些年来发展较快的肿瘤治疗技术,也是今后的重要发展方向。本实验室前期在国家自然科学基金面上项目和云南省科技攻关项目的支持下,构建了抗p21Ras细胞内抗体,旨在阻断Ras信号传导通路,靶向治疗Ras基因高表达的肿瘤。研究显示,该抗体对高表达p21Ras的人肿瘤细胞系及其裸鼠移植瘤有明显生长抑制作用。但由于该抗体使用的是复制缺陷型腺病毒,没有自我增殖能力和肿瘤靶向性。因此,本实验室对野生型Ad5腺病毒载体进行基因工程改造,用肿瘤双特异性启动子hTERT和HRE替换腺病毒复制必需区E1A区和E1B区启动子,使其赋予肿瘤细胞特异性复制能力;用35型腺病毒的纤毛蛋白替换5型腺病毒的纤毛蛋白,使其可感染CIK细胞,具有肿瘤靶向性,获得具有靶向性的肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV400;最后在KGHV400中插入p21Ras单链抗体基因即获得本研究所使用的既具有靶向性又携带抗p21Ras单链抗体治疗基因的肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV500。前期的实验研究显示,该病毒在乳腺癌的治疗中具有一定的疗效。本次研究的主要目的是:1、构建含抗p21ras单链抗体治疗基因的肿瘤特异性增殖腺病毒KGHV500;2、通过体外实验,研究KGHV500对人结直肠癌细胞SW480的影响;3、通过体内实验,研究KGHV500联合CIK细胞共同介导抗p21Ras单链抗体治疗结直肠癌的效果和安全性。最终实现抗p21ras单链抗体在结直肠癌细胞中的持续、安全表达,为结直肠癌的靶向治疗提供新方法。[方法]一、重组腺病毒KGHV500的包装、扩增和纯化:将本实验室前期构建的腺病毒穿梭质粒pXC1-hTERT-ScFv-HRE与骨架质粒pBHGE3-F5/35在低代次HEK293细胞内进行同源重组,包装成为携带有抗p21Ras单链抗体基因的重组腺病毒KGHV500。体外大量扩增该重组腺病毒,双重氯化铯密度梯度离心进行腺病毒的纯化,TCID50法测定该病毒的滴度。二、体外实验:1、KGHV500感染SW480细胞:首先检测结直肠癌SW480细胞表面是否表达KGHV500的受体CD46,以确定KGHV500可以感染SW480细胞。通过透射电镜观察,检测KGHV500可否成功感染上SW480细胞,之后用不同MOI值的重组腺病毒感染高表达p21Ras的结直肠癌细胞SW480,确定KGHV500感染SW480的最佳MOI值。2、检测KGHV500对肿瘤细胞SW480的影响:通过MTT实验、Transwell侵袭小室实验、细胞划痕实验以及TUNEL凋亡检测等方法分别对感染KGHV500后的肿瘤细胞杀伤、侵袭、迁移和凋亡的变化情况进行检测。3、CIK细胞装载KGHV500:分离人外周血单个核细胞,体外经细胞因子诱导成为CIK细胞,与携带治疗基因的的重组腺病毒KGHV500共培养,并进行感染效率的测定。三、体内实验:用人结肠癌细胞系SW480建立结直肠癌裸鼠移植瘤模型,分为5组:尾静脉注射搭载KGHV500的CIK细胞组、尾静脉注射搭载KGHV400病毒(无抗p21ras单链抗体基因)的CIK细胞组、尾静脉注射CIK细胞组、尾静脉注射KGHV500组和尾静脉注射PBS组。体内实验内容主要分为两个方面:1、每隔3天测量荷瘤鼠肿瘤的大小,绘制肿瘤生长曲线,评价携带p21ras单链抗体基因的KGHV500联合CIK细胞在体内对结直肠癌的治疗效果;2、治疗第1d,2d,3d,5d和7d的颈椎脱臼处死裸鼠,取肿瘤组织和主要脏器进行免疫组织化学检测,并通过Hscore评分和阳性细胞百分数评估腺病毒和单链抗体在肿瘤组织的表达状况,此外,还将通过蛋白免疫印迹实验来研究KGHV500联合CIK细胞在体内的治疗安全性。[结果]体外培养扩增重组腺病毒KGHV500,经过双重氯化铯密度梯度离心纯化,最终的病毒滴度为5.0×109pfu/ml。体外实验结果显示,结直肠癌细胞SW480表面有大量CD46蛋白表达(KGHV500受体)。透射电镜观察结果显示,KGHV500可成功感染SW480细胞,并且经测定,KGHV500感染SW480细胞的最佳MOI值为100。细胞划痕实验显示,当KGHV500感染结直肠癌SW480细胞之后,24h时细胞划痕迁移百分比为(1.89±3.41)%,48h时为(8.71±4.04)%。对照组24h时细胞划痕迁移百分比为(10.52±1.40)%,48h时为(22.58±4.21)%。实验组与对照组相比差异显著,具有统计学意义(P<0.05),表明KGHV500可有效抑制SW480细胞的迁移能力。Transwell侵袭小室实验显示,实验组重组腺病毒KGHV500感染SW480细胞之后,转移到微孔下层的细胞数目比对照组少很多,实验组细胞侵袭个数为27±8.73,而对照组为151.57±29.90,两组相比具有显著的统计学意义(P<0.01),表明重组腺病毒KGHV500可有效抑制结直肠癌细胞的侵袭能力。MTT实验显示,当结直肠癌细胞SW480感染上KGHV500之后,在第1、2、3、4、5天时的吸光度分别为1.64±0.13,1.45±0.15,1.11±0.23,0.90±0.12和0.49±0.12。对照组为1.68±0.13,1.80±0.08,1.71±0.14,1.95±0.13和1.91 ±0.18。实验组随着时间的推移吸光度越来越低,而对照组肿瘤细胞的吸光度一开始有上升的趋势,后来逐渐趋于平稳。结果表明KGHV500对SW480细胞具有一定的杀伤能力。TUNEL凋亡检测实验结果显示,实验组病毒感染SW480细胞之后,细胞凋亡个数明显增多,凋亡百分比为(76.34士10.05)%,对照组没有感染病毒,几乎没有凋亡细胞,凋亡百分比为(96.68±1.25)%。实验组与对照组相比差异显著,具有统计学意义(P<0.01),证明该病毒可以明显促进结直肠癌SW480细胞的凋亡。此外,通过分离人外周血单个核细胞,体外经细胞因子诱导成为CIK细胞。经过检测发现CIK细胞膜表面CD46较为丰富,阳性率几乎达到100%。实现CIK细胞成功装载携带治疗基因的的重组腺病毒KGHV500,并发现KGHV500感染CIK细胞的效率为63.15%。体内实验显示,实验组尾静脉注射装载KGHV500的CIK细胞组经过治疗后肿瘤组织大小趋于平稳,增长不明显。而对照组肿瘤组织生长较快,其中PBS组的肿瘤体积生长最快,其次是尾静脉单独注射KGHV500组、单独的CIK细胞组和KGHV400+CIK细胞组。实验组与对照组相比,尾静脉注射装载KGHV500的CIK细胞使得肿瘤体积最小,增长最为不明显,表明重组腺病毒KGHV500和CIK细胞联合有明显地抑制肿瘤生长的作用。肿瘤组织TUNEL凋亡检测显示,实验组尾静脉注射KGHV500+CIK细胞组,细胞凋亡百分比明显多于其他组,为(75±16.68)%。对照组尾静脉注射KGHV400+CIK细胞组、单独的CIK细胞组和单独注射KGHV500组凋亡百分比依次降低,分别为(56± 10.52)%、(28±7.65)%和(23±8.76)%。空白组尾静脉注射PBS的裸鼠肿瘤组织中几乎没有凋亡细胞,细胞凋亡百分比为(5±3.36)%。由此证明携带抗p21Ras单链抗体的重组腺病毒KGHV500联合CIK细胞可以明显促进结直肠癌SW480细胞的凋亡。安全性检测结果显示实验组尾静脉注射携带KGHV500的CIK细胞的裸鼠,肿瘤部位检测到了大量腺病毒的表达,实验组肿瘤组织Hscore评分在第1d、2d、3d、5d 和 7d 时分别为 62.72±6.78,130.25士22.58,179.53±42.58,200.07±48.63,250.67±52.68。阳性百分数分别为(15.52±6.59)%,(32.56±12.19)%,(42.53± 18.63)%,(60.07± 12.54)%,(78.67± 18.53)%。随着治疗时间的增加,腺病毒的表达量越来越高。另外,脾脏中发现少量腺病毒的存在,没有在其它脏器中检测到腺病毒的表达。而对照组尾静脉只注射KGHV500的裸鼠,肿瘤组织 Hscore 评分在第 1d、2d、3d、5d 和 7d 时分别为 18.2±8.59,31.62± 15.86,65.73±28.59,100.52±32.86,180.65±23.58,阳性细胞百分比分别为(5.78±7.52)%,(12.57±8.46)%,(25.73±13.59)%,(39.52±14.56)%,(45.65±17.82)%,腺病毒的表达也呈现逐渐上升的趋势,但相对较弱。此外,在其心、肝、脾和肺等组织中均检测到了腺病毒的表达。由此表明,CIK细胞携带KGHV500在体内运输的安全性良好。此外,免疫组化结果显示,实验组肿瘤组织单链抗体的表达Hscore评分在在第1d、2d、3d、5d和7d时分别为31.47±8.78,100.84±12.60,130.47±42.54,177.47±35.48,220.59±46.28。阳性百分数分别为(16.48± 11.59)%,(42.54± 18.24)%,(45.67±8.15)%,(60.65± 12.12)%,(78.05±20.54)%。随着治疗时间的增加,单链抗体的表达量越来越高。而对照组尾静脉只注射KGHV500的裸鼠,肿瘤组织Hscore评分在第1d、2d、3d、5d 和 7d 时分别为 12.24±2.59,28.44±14.60,50.95±11.92,83.25±32.20,130.64±40.23。阳性细胞百分比分别为(4.28±3.12)%,(12.54±8.50)%,(18.83±13.25)%,23.64± 15.21)%,(40.65± 19.20)%,单链抗体的表达也呈现逐渐上升的趋势,但相对较弱。Western blot的结果显示,实验组只有肿瘤部位和脾脏中存在单链抗体的表达,其余组织全部为阴性结果。而对照组尾静脉注射单独的KGHV500组的裸鼠,除了脑组织以外,均检测到了单链抗体的表达。[结论]1、通过构建重组腺病毒KGHV500,将其成功感染CIK细胞,实现了CIK细胞作为载体靶向运输携带抗p21ras单链抗体基因的KGHV500肿瘤特异性增殖腺病毒;2、通过细胞划痕、Transwell侵袭、MTT和TUNEL凋亡等体外实验,证实了重组腺病毒KGHV500可有效抑制肿瘤细胞SW480的生长、侵袭和迁移,促进肿瘤细胞凋亡;3、通过建立裸鼠结直肠癌移植瘤模型,体内有效性和安全性检测,证实了重组腺病毒KGHV500联合CIK细胞可以有效抑制肿瘤组织的生长,促进肿瘤细胞的凋亡,并且治疗的安全性良好。本次研究通过靶向治疗、免疫治疗与基因治疗相结合的肿瘤治疗策略,为结直肠癌的治疗提供新方法。