恒定链(invariant chain，Ii)是一种非多态性Ⅱ型跨膜糖蛋白。Ii作为MHC-Ⅱ分子的伴侣蛋白，在抗原呈提通路中起着重要作用：(1)辅助MHC-Ⅱ类分子合成；(2)阻止M=HC-Ⅱ类分子与内源性抗原肽结合，保护未成熟MHC-Ⅱ类分子；(3)作为MHC-Ⅱ类分子内化信号，调节其分选/内化。研究表明，Ii还与CD4<+>T细胞及B细胞的分化、成熟有很大关系。为探索Ii在免疫应答中的功能及其作用机理，本研究进行了小鼠Ii基因的克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备。 首先，根据GenBank中登录的小鼠Ii基因mRNA序列与载体pGEX-4T-1的多克隆酶切位点设计了一对上下游引物P<,1>、P<,2>，通过反转录．聚合酶链式反应技术，从小鼠脾脏组织总RNA中扩增出一条特异性基因片段，经HindⅢ单酶切鉴定，与GenBank中登录的小鼠Ii基因序列含有相同的单酶切位点。然后将该基因片段插入载体pGEX-4T-1多克隆位点，构建Ii的原核表达重组质粒。经质粒PCR和EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切鉴定，筛选出阳性克隆进行DNA序列测定。结果表明本实验成功克隆到小鼠Ii基因，长度为700bp，包含完整的开放阅读框，编码213个氨基酸。克隆所得到的小鼠Ii基因与GenBank中登录(登录号：NM010545、BC096435)的鼠Ii基因有5个核苷酸的差异，其同源性均为99.2％；与登录号为BC061489鼠Ii基因仅有一个核苷酸的差异，同源性为99.8％，所编码氨基酸序列均完全相同。 其次，把经鉴定构建成功的重组质粒pGEX-4T-1-Ii转化到大肠杆菌BL21中，经1.0mmol/L IPTG的诱导在37℃表达，表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳检测。结果表明，所克隆得到基因片段在大肠杆菌BL21中获得有效表达，表达产物主要是以包涵体形式存在的融合蛋白GST-Ii。所获得的融合蛋白分子量分别约为49.5KD，与预期结果相符。 最后，通过对原核表达条件的优化，确定了最佳诱导时间和最佳诱导剂浓度。我们用优化的表达条件对含有pGEX-4T-1-Ii重组质粒的BL21菌进行了大量诱导表达，实验中使用反复冻融和超声波方法来裂解诱导表达菌，结合十二烷基肌氨酸钠法，提取了大量的可溶性GST-Ii融合蛋白。在对目标蛋白进行复性与纯化后，用其免疫家兔，制备了针对该蛋白的兔抗鼠多克隆抗体，ELISA和Western Blotting证明所制备的多克隆抗体具有良好的免疫活性和特异性。 综上所述，本研究成功地克隆了小鼠Ii基因，对其进行了原核诱导表达，获得了大量的GST-Ii原核融合表达蛋白，并制备了针对该融合蛋白的多克隆抗体。这些都为进一步研究小鼠Ii分子免疫学功能及其应用提供了试验材料。