内醚糖的生物利用与内醚糖激酶的研究

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过控制热解条件,能从纤维素生物质获得主要的产品--内醚糖(Levoglucosan),全名1,6-缩水-β-D-吡喃葡萄糖,产率可达30.4%。随着世界性的能源危机,特别是采用快速热解工艺使得从富含纤维素生物质获得热解产物的产量大幅度提高,利用热解产物--内醚糖作为微生物发酵碳源和能源的研究越来越受到重视。本论文以内醚糖的利用为出发点,简化了内醚糖的制备方法;研究了内醚糖的不同处理下,微生物的转化利用情况;对其关键酶--内醚糖激酶的性质进行了研究;对此酶的基因进行了克隆鉴定;并对环境中内醚糖同化微生物和内醚糖对环境微生物群落的影响进行了研究。   对从纤维素热解液中分离纯化内醚糖的方法进行了优化,得到的内醚糖纯度较高,可达95%以上。将内醚糖经不同处理,以黑曲霉诱变菌CBX-209为发酵菌株,以葡萄糖为对照,添加不同氮源,研究内醚糖不同处理下的利用情况。   为了进一步提高内醚糖的利用效率,我们对内醚糖激酶进行了分离纯化及酶性质的研究。结果表明,该酶的最适反应温度是30℃,最适反应pH为9.0;在pH6~10的范围内都比较稳定,对碱性条件的耐受力大于酸性条件;在低于20℃的条件下,酶活性都比较稳定;对内醚糖和ATP的Km值分别为80mM和0.25mM;底物的专一性很强;用MALDI-TOF对肽指纹图谱的分析显示该蛋白是一种新的、未报道的蛋白。最终得到了内醚糖激酶的基因,并对此基因通过在酿酒酵母H158中表达进行了验证。   对土壤中内醚糖同化菌的分布及其对环境微生物群落的影响进行了研究。结果表明几株丝状真菌:和酵母具有较强的内醚糖磷酸化能力。其中酵母多为隐球酵母。对此8种真菌的内醚糖激酶初纯液性质的研究表明,它们从pH4~7稳定性越来越高,在pH7~10的范围内比较稳定,然而在pH达到12时,酶剩余活性为零,在碱性条件下的稳定性,大于酸性条件下;在4-30℃的范围内比较稳定,高于30℃后酶迅速失活;它们对内醚糖的Km值大不相同,霉菌的都低于酵母的,其中Chw①(Rhodotorula aurantiaca)的Km值最高为102 mM,而Yt5(Penicilkum herquer)的最低为48mM,前者大约是后者的两倍,但是它们对ATP的Km值却趋于一致,都在0.2 mM~0.35 mM的范围内。   内醚糖对土壤水溶液中微生物群落的影响表明:环境中添加内醚糖后,会对原核微生物群落产生一定的影响。DGGE图谱检测显示,四种微生物成为优势菌群,它们都属于未鉴定、亲缘关系较近的芽孢杆菌的新种。
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