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布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌引起的世界范围流行的人兽共患病,给畜牧业发展和人民健康带来了巨大的危害。布病的诊断国家标准中所列方法是基于LPS抗原或全菌体蛋白来进行设计的,无法区分疫苗接种与野毒株感染引起的抗体反应,这不利于布病的清除。随着蛋白组学的发展,利用高通量技术筛选具有诊断功能的蛋白分子成为可能。本研究利用免疫沉淀(IP)分离了布鲁氏菌M28和M5-90接种羊180天血清反应蛋白,并利用高通量Label-free技术对其进行质谱分析。结果显示:共检测到1940个有效蛋白,按照差异倍数大于1.5,且在血清持续存在6个月的标准,筛选到71个差异表达蛋白,M28与M5-90相比上调14个,下调有23个,只在M28组表达19个,只在M5-90中表达15个。蛋白B0715、A0248、A0251、A0249、B0713、A0253和A0225在布鲁氏菌接种后6个月内,M28组分别比M5-90组上调46.0、19.6、10.7、8.8、8.8、8.6和7.5倍。为了检测7个差异倍数显著的布鲁氏菌蛋白的抗体反应性及标签蛋白是否影响差异蛋白的抗体反应性,本文选择3种原核系统表达差异蛋白,结合iELISA筛选其作为诊断蛋白的功能。结果显示:1.pMAL和pET32a系统中标签蛋白存在交叉反应,而pET28a不存在交叉反应。2.初步鉴定蛋白A0253具备诊断功能,并兼具鉴别强毒株(M28)和疫苗株(M5-90)感染功能。sRNA与细菌代谢、毒力决定和环境适应等方面发挥着重要的调控作用。本实验室前期研究中,以布鲁氏菌强毒株M28为对象,通过转录组测序、筛选并验证了几个新sRNA,并证明了Bmsr1降低毒力作用,Bmsr10也是本团队发现的新sRNA之一。本文利用同源重组构建布鲁氏菌Bmsr10的缺失株,通过对布鲁氏菌体内外增殖能力的检测,分析Bmsr10缺失对布鲁氏菌M28毒力的影响,结果发现:缺失Bmsr10并不影响布鲁氏菌M28在液体基TSB上的生长,细胞感染实验显示:M28ΔBmsr10在感染巨噬细胞48 h后胞内增殖能力显著下降(p<0.05)。小鼠实验结果显示:M28ΔBmsr10在感染后1、3、5和7周小鼠脾的分菌数均显著低于M28(p<0.01);在感染1、3和5周后小鼠的脾重均显著下降(p<0.001)。证明Bmsr10的缺失显著降低布鲁氏菌M28的毒力。综上所述,本研究通过对与布鲁氏菌血清结合的M28和M5-90的差异蛋白进行了分析,筛选到71个在布鲁氏菌M28和M5-90的差异表达蛋白,利用iELISA对差异蛋白抗体反应性进行了初步的研究。并研究了sRNABmsr10对布鲁氏菌M28的毒力影响。结果显示:1、蛋白A0253具备诊断功能,并兼具鉴别强毒株(M28)和疫苗株(M5-90)感染功能。2、sRNABmsr10的缺失对马耳他布鲁氏菌体外的生长无变化,但显著降低了其在巨噬细胞内和小鼠体内的增殖能力。该研究为构建区分是否感染布病和鉴别布鲁氏菌的自然感染和疫苗免疫诊断试剂和靶标疫苗奠定了基础。