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研究背景:慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是世界范围内流行最广的慢性病毒感染性疾病之一,严重危害人民健康。目前慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,CHB)最主要的治疗方法是抗病毒治疗,但是现有的抗病毒治疗策略均不能彻底治愈慢性乙型病毒性肝炎。HBV感染慢性化的主要原因是由于宿主的细胞免疫功能受损,但其确切机制不明。越来越多的证据显示B细胞参与了HBV感染宿主的免疫调控,新近研究发现其中调节性B细胞(regulatory B cells,Breg)可能起到重要的免疫负性调控作用。既往有研究报道Breg细胞可通过Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)参与慢性HBV感染的病理过程。在本论文中,我们系统观察不同免疫状态的慢性HBV感染者外周血Breg细胞比例及其表面TLRs表达的变化规律,并结合临床特征明确上述免疫学指标变化的临床意义,并探讨相关的病原相关分子模式(Pathogen Associated Molecular Pattern,PAMP)对Breg细胞克隆扩增和功能的影响,阐明Breg细胞在慢性HBV感染中对T细胞的负性调控作用,从而有助于完善慢性HBV感染免疫受损机制,同时为寻找免疫治疗新靶标提供依据。研究方法:纳入南京大学医学院附属南京鼓楼医院感染科肝炎门诊2013年11月至2016年7月就诊的不同免疫状态的慢性HBV感染者166例,其中免疫耐受期(immune tolerant phase,IT)患者 43 例,免疫活化期(immune reactive phase,IA)患者 71 例,非活动HBV携带状态(inactive HBV carrier state,IC)患者52例,并纳入50例健康个体作为对照组(healthy controls,HC),流式细胞术检测其外周血Breg细胞(CD24hiCD38hi B 细胞)比例,同时检测 Breg 细胞 TLR2,TLR4,TLR6,TLR9,IL-10和IL-35的表达情况。收集部分慢性HBV感染者及健康个体血清,Luminex技术检测血清IL-10水平,同时采用ELISA方法检测血清B细胞活化因子(B cell activating factor,BAFF)水平。分离健康个体及慢性HBV感染者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),以 HBsAg、HBcAg 刺激培养后采用流式细胞术检测Breg细胞比例变化并采用ELISA方法检测培养上清IL-10水平变化,以明确HBV抗原对Breg细胞克隆扩增和功能的影响。磁珠分选出健康个体B细胞及T细胞,分别刺激活化后采用流式细胞术分选出Breg细胞,构建Breg细胞和T细胞共同培养体系,采用流式细胞术检测T细胞亚群变化以及T细胞PD-1、CD69表达,采用ELISA方法检测T细胞分泌细胞因子情况,以明确Breg细胞对T细胞的影响。结果:(1)166例慢性HBV感染者中男性104例,女性62例,平均年龄为31.40±8.07岁,50例健康对照者中男性30例,女性20例,平均年龄为32.20±9.48岁。IA组ALT和AST水平均显著高于IT、IC和HC组。(2)CHB患者外周血B细胞比例显著高于HC组,且主要以IA组升高为主。CHB患者外周血Breg细胞比例显著高于HC组,且IA组Breg细胞比例高于IT和HC组,同时IC组Breg细胞比例也高于HC组。(3)CHB患者B细胞及Breg细胞TLR9的表达均较HC组低,而CHB患者Breg细胞TLR2的表达较HC组高。但TLR4,TLR6,IL-10和IL-35的表达在CHB患者和HC组之间无差别。(4)CHB患者血清IL-10水平较HC组高,且主要以IA组升高为主,并且和ALT、AST水平呈显著正相关。CHB患者血清BAFF水平较HC组低,且主要以IT组为主,并且和ALT、AST水平呈显著负相关。(5)CHB患者外周血Breg细胞比例与ALT、AST水平呈正相关,而与HBV DNA、HBsAg、HBeAg等水平无显著相关性。(6)HBcAg能诱导CHB患者Breg细胞增加,且产生IL-10增加,而对健康个体则无此作用。CHB患者和HC均无法被HBsAg诱导产生Breg细胞。(7)Breg细胞能通过上调CD4+T细胞表面PD-1的表达而抑制CD4+T细胞,且能抑制 IL-2、IFN-丫、IL-10、IL-8 和颗粒酶 B(Granzyme B,GrB)等细胞因子的产生。结论:(1)CHB患者外周血Breg细胞比例及IL-10分泌水平较HC高,且不同免疫状态间有差别,Breg细胞可能作为CHB患者进入免疫活化期的标志。Breg细胞TLR9和TLR2的表达在CHB患者和HC者之间有差别,但慢性HBV感染是否通过TLRs途径影响Breg细胞的功能尚待进一步研究。(2)HBcAg能够诱导CHB患者Breg细胞增加,且IL-10产生增加。(3)Breg细胞能够抑制CD4+T细胞及T细胞相关的细胞因子的产生。