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禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenicEscherichia.coli,APEC)是一种感染后引起鸡、火鸡及其他禽类局部或全身性感染的肠道外致病性大肠杆菌,该病原主要引起呼吸道感染、多发性浆膜炎、心包炎、气囊炎、败血症等严重的肠道外感染,给世界范围内的养禽业带来巨大的经济损失。本次实验中,我们一共分离到75株禽致病性大肠杆菌噬菌体,对其中的部分噬菌体做了生物学特性分析。筛选出一株温和噬菌体P88,对其进行基因组测序,比较基因组分析,以及改造尾丝蛋白的初步探索等实验研究。并且利用Tn5转座子插入突变技术,以APEC菌株XM和T4-like噬菌体QL01来筛选与噬菌体受体相关的基因,并利用无痕缺失同源重组技术,构建三株缺失株,为探索烈性噬菌体的受体和噬菌体侵染大肠杆菌的机制提供了新的思路。1禽源大肠杆菌噬菌体的分离纯化及生物学特性分析本试验从南京某地区菜市场采集多份鸭粪样品,利用双层平板法来分离纯化噬菌体。实验中一共得到75株禽致病性大肠杆菌噬菌体。通过测定宿主谱发现,不同噬菌体可以裂解2-29株细菌。我们对其中的部分噬菌体做了热稳定性、最佳感染复数等生物学特性分析。选取了 11株噬菌体,在不同的培养温度和培养时间的条件下,观察到有些噬菌体的噬菌斑直径可以达到5.0mm。用透射电子显微镜观察了三株噬菌体,结果显示它们都属于肌尾噬菌体科(Myoviridae family)中的T4-like噬菌体属。2溶源噬菌体P88的分离及基因组分析采用丝裂霉素C诱导54株溶源菌,利用双层平板法获得了两株溶源噬菌体P88和pro147,且都属于P2-like噬菌体。我们对噬菌体P88进行全基因组测序,结果显示,P88基因组是双链DNA,一共含有53个可能的ORF,GC含量为52.9%,全长为35814bp,没有tRNA。比对噬菌体P88和pro147的基因组发现,同为P2-like噬菌体的P88和pro147,与噬菌体P2的相似性差别很大(相似性分别为covering 5%,ident 90%和covering 75%,ident 97%),并且两株噬菌体本身的基因组相似性非常低(covering 6%,ident 92%)。然而比较尾丝蛋白氨基酸序列,发现相似度非常高(covering 100%,ident 70%),但在C-末端存在两个高变区,分别为576-695位氨基酸(120aa)和716-746位氨基酸(31aa),我们推测,尾丝蛋白氨基酸序列中高变区的存在,可能影响了两株噬菌体的宿主谱,这为我们的实验操作提供了一定的理论依据。3 Tn5转座子筛选与噬菌体受体相关的基因转座子随机插入突变是基因组分析的重要基因操作工具技术,当转座子插入基因组后,可能会引起插入位点所在基因失活。本实验利用Tn5转座子的这一特性,建立突变库,筛选与禽致病性大肠杆菌T4-like噬菌体受体相关的基因。以携带PUT-Mini-Tn5-Km质粒的大肠杆菌S17-1(Xpir)为供体菌,以萘啶酸诱导的大肠杆菌XM为受体菌,采用双亲结合法,通过双抗平板(氨苄抗性和萘啶酸抗性)筛选接合成功的菌株。采用点滴法,利用T4-like噬菌体QL01进一步筛选,选出3株可能与噬菌体受体相关的突变株,通过Tn5转座子设计反向引物,分析比对相关基因序列,确定其中两株与脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)相关,另一株与肽聚糖(Peptidoglycan,PG)有关。我们利用无痕缺失同源重组技术,成功构建3株缺失株。用噬菌体QL01点滴不同菌株,野生株XM可以观察到明显的噬菌圈,转座子插入突变株不能观察到噬菌圈,对缺失与受体相关基因的菌株而言,在平板上也可以观察到被噬菌体裂解后留下的模糊的噬菌圈轮廓。通过重复的实验验证,我们发现,野生株、突变株和缺失株在平板上能够稳定地表现出这样的裂解现象。