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目的： 很多肿瘤可以通过分泌TGF-β抑制NK及T淋巴细胞的功能，促进肿瘤的发生与发展。NK细胞有激活和抑制型两种受体，NK细胞是否有杀伤功能取决于它所接受的激活型信号和抑制型信号的强弱。NKG2D是NK细胞的激活型受体，其信号可以介导NK细胞的杀伤功能。因此我们首先克隆了TGF-βRⅡ的胞外段和跨膜区以及NKG2D的胞内段（TN）基因，用重叠延伸拼接PCR（SOE-PCR）的方法将两段基因拼接起来。并采用了慢病毒感染的方法制备了携带TN的NK-92稳转细胞系。表面TGF-βRⅡ的表达可以将NK细胞靶向到高表达TGF-β的肿瘤微环境，与TGF-β的结合可以激活NKG2D的活化信号，即激活NK细胞的杀伤功能；与微环境中TGF-β的结合还能够降低其对其它细胞的抑制及对调节性T细胞的诱导。我们通过体外和体内实验研究了携带TN的NK-92细胞的肿瘤免疫治疗作用。 方法： （1）采用RT-PCR和重叠延伸PCR获得TN基因，构建含有重组TN基因的慢病毒穿梭质粒，并与其它包装质粒一起通过磷酸钙转染293T细胞，得到假病毒，用于感染NK-92细胞，获得携带TN基因的NK-92细胞系。 （2）通过Elisa方法检测肿瘤细胞分泌TGF-β1的分泌，获得高表达TGF-β1用于肿瘤杀伤和动物模型的肿瘤细胞系 （3）通过Transwell实验，Cell Counting Kit-8（CCK8）表达检测NK-92-TN细胞的迁移及存活能力。 （4）通过细胞毒实验，流式细胞术方法分析NK-92-TN的肿瘤细胞杀伤能力和激活程度。 （5）通过将脐血来源的CD4+T细胞在TGF-β1诱导下与NK-92-TN细胞共培养，检测其对调节性T细胞分化的影响。 （6）采用肝癌SMMC7721细胞移植肿瘤裸鼠模型，研究NK-92-TN细胞的肿瘤免疫治疗作用。 结果： （1）成功克隆了TGF-βRⅡ的胞外段和跨膜区以及NKG2D的胞内段（TN）这一段融合基因，获得了慢病毒重组穿梭质粒，并与其它包装质粒一起通过磷酸钙法感染293T细胞，获得了NK-92-TN稳转细胞系。 （2）检测发现SMMC7721，HepG2肝癌细胞可以分泌较高水平的TGF-β1。 （3）通过CCK-8检测和Transwell实验发现，NK-92-TN细胞的存活和迁移能力较对照细胞系更强。 （4）与对照细胞系相比，NK-92-TN细胞表面NKG2D的表达更高，且不受TGF-β1的抑制。同时较对照细胞其IFN-γ分泌水平较高。 （5）与对照细胞系相比，NK-92-TN细胞的肿瘤杀伤作用更强，而且在TGF-β1的刺激下，NK-92-TN细胞的杀伤作用提高，表明TGF-β1对NK-92-TN细胞具有活化作用。 （6）与对照组相比，NK-92-TN细胞能够抑制调节性 T细胞的分化，且具有剂量依赖性。 （7）体内实验初步证明了 NK-92-TN细胞联合低剂量放疗能够有效地抑制肝癌细胞的生长。 结论： 本研究所构建的NK-92-TN细胞系较对照细胞呈活化状态，并且在TGF-β1的作用下，其活化、迁移及杀伤活性不仅没有受到抑制，反而被进一步激活。体内实验也初步证明了NK-92-TN细胞治疗能够有效地抑制肝癌的生长。