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背景1.众所周知糖尿病视网膜病变中的视网膜的血-视网膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)的破坏以及血管的渗漏,是导致视力下降的主要原因。而在糖尿病视网膜病变中,由于高糖诱导的氧化应激反应以及炎症反应,都是产生严重糖尿病视网膜病变并发症的主要原因。2.视网膜新生血管生成(RNV)可发生于多种眼病,RNV可以导致视网膜出血甚至脱离,所以抑制病理性RNV已逐渐成为眼科疾病治疗中的重点。α-黑素细胞刺激素(α-MSH)对视网膜发育过程中的生理性血管生成有抑制作用,但其在病理性RNV方面的作用尚未见报道。目的1.本实验目的在于保护在早期糖尿病视网膜病变时受损的视网膜,抑制血-视网膜屏障的破坏以及血管的渗漏,要研发一种有效的介入方式用来对抗早期糖尿病视网膜病变的致病因素。我们试图在本次研究中,用于研究α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)对于早期糖尿病视网膜病变大鼠视网膜中的血管高透过性,视网膜形态的变化以及电生理功能障碍的保护作用。2.我们分别在大鼠视网膜和猴视网膜血管的内皮细胞RF6A细胞中,研究了α-MSH在高糖环境中细胞抗高透过性的作用机制,并且初步探讨介导α-MSH保护作用的MCR亞型。在实验中,我们还构造了高糖高脂的细胞环境,对其RNA进行测序分析,希望找到发生改变明显的Lnc RNA,从而对其进行分析,进而找到合理的治疗靶点。3.以氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠为模型,研究向玻璃体腔注射不同浓度的α-MSH对于视网膜病理性新生血管生成的作用。方法1.实验中,我们选取清洁级别的Sprague Dawley大鼠(SD)大鼠,通过鼠尾静脉注射链霉素(STZ)来诱导糖尿病大鼠模型。在大鼠鼠尾静脉注射成功诱导高血糖之后的第1周和第3周,向玻璃体腔注射α-MSH或者生理盐水。在之后的两周,进行伊文思蓝染色实验,透射电子显微镜实验,视网膜电图ERG实验和苏木精伊红染色H&E实验,来测试α-MSH对于早期糖尿病视网膜病变大鼠的保护作用。2.本次实验对于抗炎症因子和血-视网膜屏障的紧密连接成分在m RNA和蛋白质水平的表达进行了分析。实验结果显示,在高糖溶液处理的RF6A细胞单层transwell培养中,使用测定跨内皮细胞电阻的方法和荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖测定方法,以此来确定α-MSH对于早期糖尿病视网膜病变中血管内皮细胞抗高透过性的作用。除此之外,实验还使用了通用MCR阻滞剂和特定的MCR阻滞剂来研究介导α-MSH保护作用的MCR亞型。实验中使用了高糖高脂条件来刺激视网膜血管内皮细胞,在此之后检测RF6A细胞中的RNA,筛选出表达改变的非编码长链RNA。3.实验选取健康清洁级的C57BL/6J幼鼠(7日龄),并按照随机分为OIR+α-MSH-1组、OIR+α-MSH-5组、OIR+α-MSH-10组、OIR组和正常对照(Normal)组,每组8只幼鼠。不同剂量α-MSH干预组和OIR组幼鼠在高氧环境下(氧浓度75±2%)饲养5 d,然后在普通空气环境中饲养5 d,Normal组幼鼠则在普通空气环境下饲养10 d。各组取17日龄鼠,球后静脉注射高分子量异硫氰酸葡聚糖(FITC-dextran,平均分子量2,000 k D),之后制备视网膜铺片,观察视网膜的血管形态,计算无灌注区面积相对于整个视网膜的面积。对小鼠眼球行石蜡切片和苏木精-伊红(H&E)染色,并且计数突破内界膜突入玻璃体腔的血管内皮细胞核数。使用收集的视网膜标本进行蛋白芯片技术分析,对于在OIR小鼠中表达明显变化的蛋白进行筛选,进而为下一步的研究筛选靶点。结果1.伊文思蓝染料实验显示,在早期糖尿病视网膜病变大鼠的视网膜中,可以检测到血-视网膜屏障的损伤以及视网膜血管的渗漏现象,并且从定性和定量两方面可以证明α-MSH的保护作用。透射电子显微镜的实验结果显示,在早期糖尿病视网膜病变的大鼠视网膜中,经过α-MSH治疗的大鼠视网膜和脉络膜血管的超微结构与未经过治疗组相比较,均有明显的改善;苏木精伊红染色H&E实验显示,经α-MSH治疗大鼠的视网膜全层及各层的厚度与未经治疗组相比有明显增加,并且同正常对照组相近;大鼠电生理ERG实验显示,经α-MSH治疗大鼠的视网膜部分电生理功能恢复。2.在分子作用机制方面,在早期糖尿病视网膜病变中,α-MSH可以分别从转录水平和蛋白质表达水平纠正异常表达的促炎症反应因子和紧密连接基因;此外,在高糖溶液刺激的RF6A细胞中,α-MSH可以抑制跨内皮细胞电阻实验中的异常变化以及细胞的高透过性;通过使用通用MCR抑制剂和特定MC4R的抑制剂,可以消除α-MSH的这种保护作用。运用RNA基因测序的方法,按照变化程度排列出表达有明显差异的非编码长链RNA。3.视网膜铺片结果显示,Normal组、OIR组、OIR+α-MSH-1组、OIR+α-MSH-5组和OIR+α-MSH-10组视网膜无灌注区相对面积分别为0.00%±0.00%、23.01±3.39%、18.14%±7.20%、15.64%±7.07%和7.62%±6.52%,各组间视网膜无灌注区相对面积总体比较,差异有统计学意义(F=19.635,P<0.05);其中OIR组无灌注区相对面积显著高于Normal组和OIR+α-MSH-10组,差异具有统计学意义(t=22.946,P<0.001;t=4.293,P<0.01)。组织病理学检查结果显示,Normal组、OIR组、OIR+α-MSH-1组、OIR+α-MSH-5组和OIR+α-MSH-10组突入玻璃体腔的血管内皮细胞核数分别为0.00±0.00、11.45±4.26、6.35±2.34、4.96±1.79和1.03±1.25个。各组突入玻璃体新生血管内皮细胞核数总体比较,差异具有统计学意义(F=147.87,P<0.05);其中OIR组突入玻璃体新生血管内皮细胞核数显著高于Normal组、OIR+α-MSH-1组、OIR+α-MSH-5组和OIR+α-MSH-10组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。使用收集的视网膜标本进行蛋白芯片技术分析,对于在OIR小鼠中表达明显变化的蛋白进行筛选,发现SELP蛋白表达明显升高。结论1.本研究率先研究了α-MSH在早期糖尿病视网膜病变中,对于视网膜的血-视网膜屏障破坏和血管渗漏作用的保护作用,而且还改善了视网膜的电生理功能和超微结构。2.α-MSH对于早期糖尿病视网膜病变中的视网膜有保护作用,这可能与α-MSH的抑制促炎症因子并且增加紧密连接成分的功能有关,而这些功能主要通过α-MSH通过MC4R介导对于视网膜微血管内皮细胞的抗细胞高透过性的作用。而在随后进行的RNA测序分析中,我们也得到了改变明显的Link RNA,进而为下一步的研究提供了重要的靶点。3.α-MSH可减少OIR小鼠模型视网膜中无灌注区的相对面积和视网膜新生血管核数,其对病理性RNV的抑制作用呈剂量依赖性。