组蛋白去乙酰化酶10在吸烟诱导的肺动脉高压中的作用及机制

来源 :华中科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:mikamireiko
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实验目的本实验室前期研究表明吸烟可诱导肺动脉内皮损伤并释放内皮细胞外囊泡(endothelial extracellular vesicles,e EVs),进而通过其携带的miR-1249促进肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)的发生,其可能机制涉及miR-1249靶向肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)内组蛋白去乙酰化酶10(histone deacetylase 10,HDAC10),本课题拟进一步探讨HDAC10及细胞外钙敏感受体(extracellular calcium-sensing receptor,Ca SR)在吸烟诱导PH发生中的作用,以及e EVs所携带的mi R-1249靶向HDAC10,进而调控Ca SR,促进PASMCs增殖、诱导肺动脉高压的分子机制。实验方法1.构建香烟烟雾(cigarette smoke,CS)暴露肺动脉高压大鼠模型,real-time q PCR检测模型动物肺动脉中HDAC10和CaSR mRNA表达水平,Western Blot检测肺动脉中HDAC10和CaSR蛋白表达水平;2.气道滴注慢病毒过表达HDAC10后构建CS暴露肺动脉高压大鼠模型,Powerlab系统测量大鼠平均肺动脉压力(mean pulmonary arterial pressure,m PAP)、热稀释法测量大鼠心输出量(cardiac output,CO),根据公式PVR=m PAP*1000/CO计算肺血管阻力(pulmonary vascular resistance,PVR)。分离并称量右心室(right ventricular,RV)、左心室及室间隔(the left ventricle together with the septum,LV+S)重量,并计算右心室肥厚指数RV/(LV+S);将大鼠肺组织石蜡包埋、切片、HE染色后,统计血管壁厚度占血管外径的百分比(WT%)和血管壁面积占血管总面积的百分比(WA%);3.下调HDAC10后Western Blot检测PASMCs中p65表达水平,基于ELISA的转录因子活性检测方法检测NF-κB活性;4.梯度离心法收集香烟提取物刺激或未刺激肺动脉内皮细胞产生的细胞外囊泡(e EVs_CSE),CCK-8试剂盒检测PASMCs增殖,Western Blot检测PASMCs中cleaved caspase 3表达水平。实验结果1.经过不同时间(1w,2w,3w,4w,5w)的香烟烟雾(CS)暴露后,大鼠肺动脉中HDAC10 m RNA和蛋白表达降低,CaSR mRNA和蛋白表达增加;2.CS暴露诱导大鼠PH的发生,过表达HDAC10显著抑制CS暴露引起的大鼠mPAP、PVR、RV/(LV+S)、WT%和WA%升高;3.下调HDAC10后PASMCs中乙酰化p65表达水平增加,NF-κB活性增强;4.香烟提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导PASMCs Ca SR m RNA表达水平显著升高,使用NF-κB抑制剂(SN50)后,CSE诱导的Ca SR m RNA表达降低;5.香烟烟雾刺激肺动脉内皮细胞产生细胞外囊泡(e EVs_CSE),该种e EVs富含mi R-1249,可显著诱导PASMCs增殖、抑制细胞凋亡(cleaved caspase 3表达下调);香烟烟雾刺激转染mi R-1249 inhibitor的肺动脉内皮细胞所产生的细胞外囊泡(e EVs_CSE_mi R-1249 inhibitor)诱导PASMCs增殖、抑制凋亡的程度均显著低于e EVs_CSE;且过表达HDAC10或敲除Ca SR均可显著抑制e EVs_CSE诱导的PASMCs增殖,并减轻e EVs_CSE对PASMCs凋亡的抑制。6.e EVs_CSE诱导野生型大鼠m PAP、PVR、RV/(LV+S)、WT%和WA%显著升高,HDAC10过表达可抑制e EVs_CSE诱导的大鼠肺动脉高压,同时,在Ca SR敲除大鼠中e EVs_CSE未诱导m PAP、PVR、RV/(LV+S)、WT%和WA%发生明显变化。实验结论香烟烟雾暴露刺激肺动脉内皮细胞产生细胞外囊泡,通过其携带的mi R-1249靶向下调PASMCs中的HDAC10,从而增强转录因子NF-kB p65亚基乙酰化水平,激活NF-kB,上调CaSR表达,促进PASMCs增殖并抑制其凋亡,导致PH。
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